Presupposti:
Lo sviluppo dei muscoli scheletrici nei vertebrati è regolato da una famiglia di quattro fattori di trascrizione bHLH, MyoD, Myf5, MRF4 e Myogenina. Nel topo, grazie a mutanti di delezione il ruolo dei vari membri è stato quasi del tutto chiarito. Myf5 e MyoD agiscono a monte e regolano la miogenesi epassiale e ipoassiale rispettivamente (Cossu et al. Trends in Genetics 12, 218, 1996) . Uno dei primi studi sull¿argomento aveva dimostrato che l¿assenza di Myf5 e MyoD blocca completamente la miogenesi scheletrica e l¿embrione è totalmente privo di ogni mioblasto (Rudnicki et al. Cell 75, 1351, 1993). Tuttavia questo risultato era dovuto alla simultanea inattivazione del gene MRF4, anche espresso nei somiti. Il vettore di inattivazione di Myf5 abrogava anche l¿espressione di MRF4 inattivando un importante elemento regolatore di questo gene presente nel locus di Myf5. Infatti, grazie ad un nuovo vettore di inattivazione di Myf5 che non intereferisce con l¿espressione di MRF4, il gruppo di Tajbakhsh ha dimostrato che MRF4 è sufficiente da solo per attivare in modo quasi normale la miogenesi embrionale ma non a sostenere la miogenesi fetale o adulta (Kassar-Duchossoy et. Nature 431, 466, 2004).
Il nostro gruppo ha di recente dimostrato che Myf5 e MyoD nel topo non sono equivalenti, poichè il primo, attiva la miogenesi epassiale anche in presenza di agenti genotossici e fattori di crescita che invece bloccano l¿attività di MyoD (Innocenzi et al. in preparation). Una interpretazione di questi dati in chiave evolutiva suggerisce che l¿attivazione dei muscoli epassiali sia necessaria per i movimenti precoci e quindi la sopravvivenza degli embrioni (non amniotici). Questo è dovuto al fatto che Myf5 non è fosforilabile in tirosina da chinasi indotte da danno al DNA (Abl), cosa che invece accade in una specifica tirosina di MyoD. Nel tentativo di verificare questa ipotesi in Zebrafish, abbiamo osservato che la simultanea inhibizione di Myf5 e MyoD porta ad una drammatica riduzione della miogenesi scheletrica. Sulla base di quanto noto in mammifero, abbiamo analizzato l¿espressione di MRF4, che, a differenza di quanto osservato nel topo, non è espressa nei primi somiti. Infatti, la simultanea iniezione del mRNA per MRF4 è in grado di ripristinare la miogenesi a livelli quasi normali.
Obiettivo:
La natura transiente dell¿inibizione dell¿espressione genica causata dai morfolino permette di ottenere una inibizione trasiente dell¿espressione dei geni target. Ci proponiamo pertanto di mantenere gli embrioni di Zebrafish (esposti a morfolino anti Myf5 e MyoD ± il messagero per MRF4) fino a quando i geni Myf5 e MyoD non si riattivino. Studieremo quindi se e come la miogenesi di vertebrato può procedere, in assenza dello morfogenesi iniziale che avviene durante la somitogenesi.
I risultati dovrebbero chiarire il ruolo della miogenesi somitica nello sviluppo dei muscoli scheletrici dei vertebrati