STUDIO DELLA ESPRESSIONE DI MARKERS PANCREATICI IN CELLULE DA SANGUE DI CORDONE OMBELICALE UMANO COLTIVATE IN VITRO.
Progetto PRESUPPOSTI
Il sangue di cordone ombelicale umano contiene cellule staminali in grado di originare tutte le componenti cellulari mature del sangue (HSC) e staminali capaci di differenziare in tipologie cellulari quali osso, cartilagine, adipociti , cellule epatiche , cellule muscolari denominate Multipotent Adult Progenitor cells(MAPCs)(Kogler G. et al. Exp Hematol 34(2006),1589-1595;Graf T. Blood. 99 (2002), 3089-3101.). In questi processi proliferativo-differenziativi intervengono numerosi fattori di trascrizione attivi nel reclutamento e nel mantenimento del programma di espressione genetica linea-specifici non del tutto indagati ed essenziali per qualità e sequenza di espressione( Pessina & Gribaldo , Curr Med Res Opin,2006).
Nostre precedenti osservazioni hanno mostrato, nel sangue di cordone ombelicale,cellule positive per nestina,citocheratina 8 e 18 e per fattori di trascrizione(Isl-1,Pax-4 ,Ngn-3)importanti nella differenziazione pancreatica il cui fenotipo è compatibile con quello dei precursori di transizione di cellule endocrine verso la differenziazione beta-cellulare ( Pessina et al. BBRC,323:315-322,2004).
OBIETTIVI DELLA RICERCA
Il nostro laboratorio ha individuato alcune condizioni di coltura di cellule mononucleate isolate da sangue di cordone ombelicale umano che permettono di espandere cellule positive per il fattore di trascrizione dell¿insulina (PDX-1) ed intende proseguire la ricerca come segue:
1-Caratterizzare le cellule PDX-1+ in riferimento alla espressione di altri geni importanti nella differenziazione beta cellulare( in particolare Glut-2;Pax-4;Nkx6.1;Ngn-3)
2- Valutare l¿espressione di Synaptotagmina(Ca++ sensore regolato da PDX-1)
3 Studiare le condizioni per stimolare la differenziazione di cellule con fenotipo Ins+ mediante stimolazione con GLP-1.
METODOLOGIE IMPIEGATE
Per la ricerca saranno impiegate:
a.metodologie di separazione su gradiente per isolamento di cellule mononucleate da sangue di cordone ombelicale
b.colture liquide e in mezzo semisolido(metilcellullosa)
c.tecniche di RT-PCR e western blotting per lo studio dell'espressione di mRNA e la produzione di proteine;
d. tecniche di immunocitochimica per identificare le popolazioni cellulari con fenotipo PDX-1+.