Ruolo della proteina scaffold LIN7 nella formazione di superfici polarizzate in cellule epiteliali
Progetto Presupposti: La polarità cellulare è una caratteristica fondamentale delle cellule eucariotiche, responsabile della formazione e della struttura di tessuti e organi e coinvolta in processi patologici quali l¿invasività e formazione di metastasi. In cellule epiteliali polarizzate, la formazione e mantenimento di superfici apicali libere e baso-laterali di contatto con la matrice extracellulare e con cellule vicine dipende da recettori d¿adesione e dall¿associazione di complessi multimolecolari attorno ai recettori d¿adesione che porta alla formazione sulla superficie laterale di giunzioni aderenti e strette (tight). Particolarmente rilevanti nel processo di generazione di superfici polarizzate risultano le giunzioni tight che sigillano tra loro le cellule e separano le superfici apicali dalle basolaterali; questo processo è strettamente associato alla localizzazione di due complessi multiproteici, composti dalle proteine CRB3-PALS1-PATJ e PAR3-PAR6-aPKC-Tiam1 che interagiscono tra loro tramite domini di interazione proteina-proteina.
La proteina LIN7 da noi studiata è una piccola proteina citosolica che si può localizzare alle giunzioni tight tramite associazione a PALS1 mediata dal dominio L27, mentre il partner del dominio PDZ di LIN7 alle giunzioni tight è sconosciuto.
Descrizione e obiettivo della ricerca: Allo scopo di identificare il partner di LIN7 alle giunzioni tight e di studiare il ruolo di LIN7 nella generazione della polarità cellulare abbiamo generato ed espresso stabilmente in cellule epiteliali polarizzate (MDCK) i mutanti di LIN7 mancanti dei domini d¿interazione e fusi alla proteina fluorescente (GFP). Tramite analisi biochimiche (western blot, coimmunoprecipitazioni) e morfologiche (immunofluorescenza, microscopia elettronica e freeze-fracture) analizzeremo gli effettti della overespressione dei mutanti di LIN7 sulla composizione e struttura delle giunzioni in cellule completamente polarizzate. Allo scopo di evidenziare difetti nelle giunzioni, seguiremo la formazione di nuovi contatti intercellulari dopo distruzione dell¿adesione pre-esistente (deplezione di calcio o depolimerizzazione del citoscheletro actinico). Alterazioni nella capacità di formazione delle superfici apicali saranno studiate coltivando le singole cellule in gel di collagene. Tramite questa metodologia le cellule non in grado di generare superfici apicali libere formano cisti ma non un largo lume centrale. La funzionalità delle giunzioni tight verrà inoltre analizzata misurando la resistenza trans-epiteliale e la permeabilità transcellulare durante l¿acquisizione della polarità. Questi studi ci permetteranno di dimostare il ruolo di LIN7 nella polarità e di identificare il meccanismo molecolare attraverso il quale LIN7 partecipa alla formazione di giunzioni tight.