Caratterizzazione del sito di legame del canale pacemaker cardiaco umano (hHCN4) con il farmaco bradicardizzante ivabradina

L¿attività autoritmica cardiaca generata a livello del nodo seno-atriale è il risultato di una complessa interazione di diverse conduttanze ioniche; tra queste la corrente ¿pacemaker¿ (If) svolge un ruolo importante nella genesi e modulazione della fase di depolarizzazione pacemaker (Baruscotti et al., 2005). I canali f, oltre che determinare la frequenza basale, sono anche il target della regolazione cronotropa da parte del sistema nervoso autonomo. Il meccanismo con cui si esplica tale regolazione consiste nella capacità degli stimoli autonomici di diminuire o aumentare la quantità del secondo messaggero cAMP in cellula. I canali pacemaker sono infatti modulati oltre che dal voltaggio anche dall¿interazione con il cAMP che ne aumenta la probabilità di apertura. I costituenti molecolari dei canali pacemaker sono le proteine HCN di cui sono note 4 isoforme (HCN1-4) variamente distribuite a livello cardiaco e neuronale. L¿Ivabradina è un farmaco bradicardizzante con proprietà antiischemiche e cardioprotettive utilizzato nel trattamento dell¿angina cronica ed agisce bloccando i canali f. Il nostro laboratorio ha contribuito alla caratterizzazione del meccanismo di blocco dell¿ivabradina sul canale f nativo (Bucchi et al., 2002). Inoltre, abbiamo evidenziato come l¿ivabradina blocchi i canali HCN1 con un meccanismo diverso da quello descritto per i canali nativi f che invece vengono bloccati in modo simile all¿isoforma HCN4 (Bucchi et al., 2006). Queste differenze potrebbero quindi costituire i presupposti per sviluppare dei farmaci isoforma-specifici e quindi tessuto-specifici. Questo progetto si propone quindi di individuare i residui aminoacidici coinvolti nel binding dell¿ivabradina con l¿isoforma umana del canale HCN4. In particolare, utilizzando la tecnica dell¿alanin-scanning mutagenesis intendiamo sostituire singoli aminoacidi localizzati nella probabile regione di binding del farmaco per verificarne l¿effettivo ruolo funzionale. Alcuni aminoacidi di particolare interesse sono: Y506, M508, I510, D410, D432, D521, E529. I primi 3 aminoacidi elencati corrispondono a residui dell¿isoforma mHCN1 coinvolti nell¿interazione con il farmaco bradicardizzante ZD7288 (Shin et al., 2001). Gli altri aminoacidi elencati sono invece carichi negativamente e rappresentano possibili elementi di interazione elettrostatica con l¿ivabradina (che a pH fisiologico è carica positivamente). Successivamente alla fase di mutagenesi procederemo alla caratterizzazione elettrofisiologica che verrà condotta in cellule HEK293 co-trasfettate (lipofectamina 2000) con plasmidi contenenti il cDNA dei canali mutati e del marker Green Fluorescent Protein. Il blocco dell¿ivabradina sui vari canali mutati verrà analizzato in modo da valutare eventuali differenze nella specificità, nell¿intensità e nel meccanismo in modo da individuare i residui amioacidici del canale a cui l¿ivabradina si lega.