Analisi del meccanismo di autoinibizione di ACA8, una Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica di Arabidopsis thaliana.
Progetto ACA8 è una Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica (PM) di A. thaliana. L¿enzima appartiene al sottogruppo IIB delle P-type ATPasi e interagisce con la calmodulina (CaM) a livello di un dominio autoinibitorio la cui azione è soppressa dal legame con la CaM. In ACA8, il dominio N-terminale (N-te) contiene sia il dominio autoinibitorio, responsabile dell¿interazione con una porzione intramolecolare della pompa, sia la regione in grado di legare la CaM e queste 2 regioni sono parzialmente sovrapposte. Altre P-type ATPasi correlate con ACA8 (Ca2+-ATPasi IIB animali, H+-ATPasi del PM vegetali) sono caratterizzate da un dominio autoinibitorio, ma localizzato nel C-te. Per studiare se la posizione del dominio terminale sia essenziale per la sua funzione regolativa, analizzeremo l¿effetto del riposizionamento del dominio N-te di ACA8 all¿altro lato della molecola. Utilizzando il cDNA di una forma di ACA8 che risulta costitutivamente attivata e insensibile alla CaM (D74ACA8) costruiremo mutanti in cui il dominio N-te di ACA8 sarà inserito a livello del C-te della proteina (D74ACA8Nte). Questi mutanti saranno espressi nel ceppo di lievito K616 che è privo di tutte le Ca2+-ATPasi endogene e rappresenta un ospite ideale per l¿overespressione e la caratterizzazione di Ca2+-ATPasi eterologhe. La funzionalità di D74ACA8Nte e il suo stato di autoinibizione sarà testato mediante la sua capacità di complementare il fenotipo di K616 su terreno selettivo; infatti, solo forme costantemente attivate di Ca2+-ATPasi sono in grado di consentire la crescita di K616 su terreno privo di Ca2+. Un¿analisi più fine sarà eseguita nella frazione microsomale di K616 valutando l¿attività enzimatica di D74ACA8Nte, saggiata sia come idrolisi di ATP che come trasporto di Ca2+, in funzione di concentrazioni crescenti di CaM. Per testare l¿ipotesi che differenti P-type ATPasi possano condividere un meccanismo comune di regolazione indipendentemente dalla localizzazione del dominio regolatorio, dallo ione trasportato e dalla sottofamiglia di appartenenza, costruiremo chimere in cui una forma deregolata di ACA8 è fusa al dominio C-te autoinibitorio dell¿isoforma AHA1 di H+-ATPasi del PM di A. thaliana (sottogruppo IIIA), regolata dall¿interazione con le proteine 14-3-3. Il dominio C-te di AHA1 verrà fuso alla porzione C-te di D74ACA8 e lo stato di attivazione sarà anche in questo caso analizzato in K616, come descritto precedentemente, ma in presenza o in assenza di proteine 14-3-3. Con lo stesso approccio costruiremo e analizzeremo chimere in cui la porzione N-te di ACA8 è fusa ad una forma attivata di AHA1. In questo caso l¿analisi funzionale verrà condotta nel ceppo di lievito RS72 già utilizzato con successo per la caratterizzazione di diverse isoforme di H+-ATPasi del PM di A. thaliana.