SINTESI DI 4-IDROSSI-2-NONENALE (HNE) E DEI CORRISPONDENTI ISOTOPOMERI DEUTERATI COME BIOMARKERS DI LIPOPEROSSIDAZIONE LIPIDICA
Progetto PREMESSA.
La idrossialdeide insatura 4-idrossi-2-E-nonenale (HNE) è uno dei prodotti più abbondanti e tossici tra quelli generati dalla perossidazione degli acidi grassi ¿-6 polinsaturi [Esterbauer H. et al, Free Rad. Med. (1991) 11, 81-128] e quindi la determinazione quantitativa di questo biomarker della lipoperossidazione, presente nei tessuti biologici a livelli micromolari, è stata oggetto di attente ricerche. Tra i metodi analitici proposti si distinguono quelli che utilizzano la spettrometria di massa (MS) accoppiata a gas cromatografia (GC-MS) [van Kuijk FJGM et al, Meth. Enzymol. (1990) 186, 399-406] o quelli che si basano su tecniche più recenti, quali la matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF/MS) e la electrospray ionization con tandem MS (ESI-MS/MS). Queste ultime tecniche sono particolarmente adatte alla analisi degli addotti di HNE con peptidi e proteine [Carini M. et al, Mass Spectrom. Rev. (2004) 23, 281-305]. Per la determinazione quantitativa di HNE o dei suoi addotti è necessario poter disporre di uno standard interno di HNE deuterata.
SCOPO DEL LAVORO.
Sarà studiata la sintesi dell¿isotopomero deuterato di HNE più adatto a fungere da standard interno e per questo scopo dovrà essere assicurata nella struttura la presenza di almeno tre atomi di deuterio. La scelta della più idonea via di sintesi sarà legata alla struttura degli intermedi deuterati necessari e alla loro limitata disponibilità commerciale. Pertanto, tra le sintesi di HNE non deuterata già descritte in letteratura, si sceglierà e si metterà a punto quella adatta alla preparazione del più opportuno isotopomero deuterato.
MATERIALI, METODI, FASI. Si prevede di utilizzare alogenuri di pentile deuterati disponibili in commercio; da questi saranno preparati i corrispondenti derivati magnesiaci (Grignard) che reagiranno con un opportuno intermedio aldeidico a quattro atomi di carbonio. A causa dell¿elevato costo degli intermedi deuterati e, vista la limitata quantità a disposizione di questi materiali così marcati, le reazioni saranno studiate su scala di 50-100 milligrammi utilizzando, in una prima fase, composti non contenenti deuterio. In una seconda fase, una volta perfezionato il procedimento ed il recupero del prodotto finale, le reazioni saranno ripetute con materiale deuterato.
OBIETTIVO SPECIFICO.
La sintesi così messa a punto permetterà di ottenere centinaia di mg del dimetilacetale dell¿HNE (HNE-DMA), precursore stabile della HNE che, a differenza della stessa HNE, può essere conservato senza decomporsi. L¿HNE deuterata potrà essere generata, al momento dell¿analisi, per idrolisi dell¿HNE-DMA e potrà essere utilizzata come standard interno per analisi MS dei livelli di HNE libera o dei suoi coniugati. Lo standard deuterato dovrà contenere almeno tre atomi di deuterio e, in base alla accessibilità degli intermedi deuterati, si prevede di preparare HNE contenente 5 atomi di deuterio (HNE-d5) e/o 7 atomi di deuterio (HNE-d7).