La giunzione aderente, nota come 'Ectoplasmic specialization': sua biologia, regolazione, e ruolo fisiologico nella spermatogenesi
Progetto L'infertilità maschile umana colpisce il 10-12% delle coppie. I trattamenti per l'infertilità sono limitati e le tecniche di fecondazione in vitro come IVF, ICSI, ELSI bypassano il problema , senza però né curarlo né comprenderlo. La tecnologia delle colture di cellule staminali maschili (spermatogoni) apre promettenti scenari, ma a tutt'oggi la comprensione a livello molecolare/cellulare/funzionale dell'intero processo della spermatogenesi è affidata al 'modello animale', cioè a topi che esprimano in modo mirato una determinata proteina considerata svolgere un ruolo chiave, sopprimendone (mutanti negativi, loss of function) od esaltandone (mutanti positivi, gain of fucntion) l'attività. Il modello animale progettato e generato nel mio laboratorio (Aivatiadou et al., 2007)ha permesso di stabilire che la GTPasi Rap1 è essenziale per una corretta spermiogenesi(la fase differenziativa aploide), in quanto il suo malfunzionamento e/o mancata funzione porta ad infertilità maschile dovuta al rilascio prematuro dall'epitelio seminifero di spermatidi immaturi che pertanto non differenziano in spermatozoi fertili. Questo fenotipo è risultato essere dovuto ad alterazioni a carico delle giunzioni (note come 'Ectoplasmic Specializations')che si instaurano tra cellule germinali in differenziamento e cellule del Sertoli, le somatiche di supporto. Rap1 in cellule somatiche è nota regolare l'adesione cellulare mediata sia da Integrine sia da caderine associate con il citoscheletro di actina. Noi abbiamo dimostrato che le cellule germinali esprimono la VE-caderina, cioè la specie molecolare di caderina nota avere un ruolo chiave nella stabilizzazione e dinamica della barriera endoteliale. Ciò che ora vogliamo indagare è se il malfunzionamento di Rap1 dei nostri topi mutati (esprimenti un mutante dominante negativo di Rap1 sotto un promotore cellule aploidi-specifico) si riflette sulle giunzioni VE-caderina-mediate presenti nell' epitelio seminifero. Per fare ciò verificheremo il grado di stabilità a livello di membrana della VE caderina tra topi mutati e topi wild type (estrazioni della VE caderina mediante subfrazionamento cellulare a partire da tubuli seminiferi isolati, SDS-PAGE, immunoblotting) in parallelo ad analisi di immunocitochimica/ immunofluorescenza sia su sezioni di organo sia su cellule in co-coltura. Inoltre, visto che la destabilizzazione della barriera endoteliale è stata messa in relazione alla fosforilazione in tirosina della VE-caderina, verificheremo se i topi mutati presentano VE-caderina Ptyr-fosforilata (immunoprecipitazioni, immunoblotting) a stadi in cui le giunzioni dovrebbero essere stabili. Infine, siccome fisiologicamente il rilascio degli spermatozoi maturi è dovuto al disassemblamento (sconosciuto il meccanismo di attuazione) delle giunzioni tra germinali e cellule del Sertoli, indagheremo su una eventuale , fisiologica, Ptyr-fosforilazione della VE-caderina specificatamente al momeno della spermiazione nei topi wild type