RUOLO DELLE CELLULE T REGOLATORIE E RELATIVI MARCATORI GENETICI NELLE MALATTIE AUTOIMMUNI EPATICHE

PRESUPPOSTI Il gruppo proponente ha dimostrato che donne affette da malattie autoimmuni presentano una frequenza di linfociti T e B circolanti con monosomia X molto più elevata rispetto ai controlli (Lancet 2004;363:533, J Immunol 2005;175:575) ed ipotizzato che l'instaurarsi di una progressiva aploinsufficienza di geni localizzati nel cromosoma X possa avere un ruolo nello sviluppo dell¿autoimmunità. Il fattore di trascrizione FoxP3 oltre ad essere localizzato nel cromosoma Xp11.23, è un gene regolatore chiave per lo sviluppo e l'attività della popolazione CD4+CD25+ T regolatoria (Science 2003;299:1057). La prova migliore del coinvolgimento dei linfociti T regolatori sul controllo della tolleranza immune nell'uomo è venuta dall'associazione casuale tra disregolazione immune grave, poliendocrinopatia, sindrome X-linked (IPEX) e mutazioni nel gene FoxP3 (Nat Genet 2001;27:20). SCOPI DELLO STUDIO Studiare l'aspetto fenotipico, molecolare e funzionale di alcune sottopopolazioni T a funzione regolatoria (CD4+CD25+ e CD8+CD28-) nelle malattie autoimmuni epatiche MATERIALI E METODI Verranno arruolati 100 pazienti affetti da malattie autoimmuni epatiche e 50 controlli sani. I risultati saranno valutati anche in base alla stadiazione delle patologie. Verrà valutata la frequenza a livello periferico di due sottopopolazioni cellulari regolatorie (CD4+CD25+ e CD8+CD28-) mediante citofluorimetro a quattro colori. Inoltre si procederà alla purificazione delle due sottopopolazioni mediante doppia selezione immunomagnetica per ottenere popolazioni pure di linfociti regolatori e di linfociti T effettori. Le popolazioni regolatorie saranno oggetto di una serie di valutazioni a diversi livelli secondo il seguente schema: a) caratterizzazione dei marcatori fenotipici. In particolare saranno valutati un set di markers già noti per la popolazione T CD4+CD25+reg, come l'espressione in membrana di GITR, CCR4, CD45RO, CD95 ed intracitoplasmatica di CTLA-4, mentre la caratterizzazione fenotipica delle cellule Ts CD8+, che è ancora oggetto di discussione, comprenderà marcatori già descritti per altre popolazioni regolatorie (GITR, CTLA-4, CD56, CD45RA, CCR4). b) analisi quantitativa del fattore di trascrizione FoxP3 nelle due popolazione T reg purificate mediante real time PCR. c) valutazione della capacità di inibire la proliferazione e la produzione di citochine da parte di linfociti T autologhi effettori attivati con anti-CD3. La soppressione della proliferazione verrà misurata tramite riduzione dell'incorporazione di timidina triziata a 5 giorni in presenza di linfociti regolatori rispetto alle colture di controllo. Verrà inoltre eseguita una analisi delle citochine solubili presenti nei tests di soppressione con particolare attenzione a IFN-y, IL-4, IL-10 per le colture in presenza di Treg CD4+CD25+, o di IFN-y, IL-6, IL-10, IL-12 nelle colture in presenza di TsCD8+CD28-. d) sensibilità all'apoptosi Fas-mediata mediante approccio citofluorimetrico.