Geni cellulari implicati nell¿ingresso del citomegalovirus umano in cellule endoteliali ed epiteliali
Progetto Il citomegalovirus umano (HCMV), membro prototipico dei beta-herpesvirinae, è la prima causa di infezione virale congenita negli Stati Uniti e in Europa, è fra i pricipali opportunisti nei trapiantati e nei soggetti immunocompromessi, ed un possibile cofattore nelle malattie cardiovascolari, nella sclerosi sistemica e nel carcinoma del colon.
Il locus virale UL131-128 è stato identificato come determinante essenziale del tropismo di HCMV per leucociti e cellule endoteliali (EC) ed epiteliali [Hahn et al., J. Virol. 78:10023-10033 (2004); Gerna et al, J. Gen. Virol. 86:275-284 (2005); Wang & Shenk, J. Virol. 79:10330-10338 (2005)]. Le proteine pUL130 e pUL128 sono incorporate nell'envelope come componenti periferiche, associate alle glicoproteine virali gH-gL [Patrone et al., J. Virol. 79:8361-8373 (2005); Wang & Shenk, Proc Natl Acad Sci U S A 102:18153-8 (2005)]. Il nostro gruppo ha proposto che pUL130 e pUL128 dopo l¿adesione del virus scatenino una transizione conformazionale della glicoproteina fusogena gB e l¿interazione gB/gH-gL, in tal modo attivando la fusione virus/cellula; pUL128 lega inoltre un recettore cellulare [Patrone et al., J. Virol., submitted (2007)]. pUL130 e pUL128 sarebbero quindi gli equivalenti funzionali della proteina gD di HSV-1.
La ricerca proposta mira ora ad identificare recettori cellulari di pUL130 e pUL128, con più approcci di tipo gain of function, basati sia su un¿ipotesi restrittiva che su screening cieco. Per il primo approccio, intendiamo trasfettare linee cellulari umane e di roditore non permissive per l¿ingresso di HCMV con una collezione di cDNA da geni per i recettori chemochinici umani. Le cellule saranno infettate con ceppi di HCMV UL131-128-positivi o negativi, e l¿ingresso virale sarà analizzato con saggi citologici e biochimici. Questo approccio deriva dall¿osservazione di una omologia parziale fra pUL130 e pUL128 e chemochine di tipo CXC e CC, rispettivamente [Hahn et al., J. Virol. 78:10023-10033 (2004)]. Per il secondo approccio, una library di cDNA umani da cellule HeLa (permissive per HCMV UL131-128-positivo) sarà trasfettata nelle stesse cellule, e cDNA che conferiscano suscettibilità all¿ingresso virale identificati per cicli successivi di isolamento da pool policlonali.
In entrambi i casi, i geni-candidati identificati saranno ulteriormente valutati con approcci loss of function, in cui il prodotto genico corrispondente venga bloccato in una linea cellulare permissiva per HCMV per RNA interference o con anticorpi neutralizzanti, e l¿effetto sull¿ingresso virale valutato.
L¿identificazione di uno o più recettori necessari per l¿ingresso di HCMV aprirebbe la strada alla ricerca di piccole molecole interferenti con azione antivirale, analogamente a quanto dimostrato per HIV-1.