Cellule staminali pluripotenti sono state isolate nel nostro laboratorio da embrioni ottenuti per partenogenesi, cioè senza che vi sia stata fecondazione dell¿ovocita ad opera del gamete maschile. (Brevini et al., Theriogenology 2007). Questi embrioni non sono in grado di svilupparsi fino al termine e quindi il loro uso al fine di isolare una linea staminale non comporta il sacrificio di un nuovo individuo, consentendo di evitare molti problemi etici. Quale modello sperimentale è stato da noi utilizzato il suino, che per le sue caratteristiche anatomiche e fisiologiche rappresenta uno strumento fondamentale, per lo sviluppo pre-clinico di approcci terapeutici.
I nostri sforzi si sono parallelamente indirizzati al fine di saggiare la plasticità differenziativa delle cellule staminali partenogenetiche di suino. Questo aspetto rappresenta infatti un elemento fondamentale al fine di disporre di un modello alternativo e comprovatamente solido da impiegare negli studi di terapia cellulare..Abbiamo allo scopo derivato dalle cellule partenogenetiche di suino strutture specifiche dette neurosfere e valutato la loro capacità di differenziare efficientemente in vitro in neuroni, astrociti ed oligogendrociti (Brevini et al ISSCR2007).
Ci proponiamo ora di proseguire gli esperimenti iniziati nell'ambito del progetto FIRST 2006 volti alla caratterizzazione della plasticità differenziativa delle cellule staminali partenogenetiche di suino valutando la capacità di queste cellule di differenziare nei diversi sottotipi cellulari ascrivibili alla linea ematopoietica.
Allo scopo ci proponiamo:
a) di esporre le cellule staminali partenogenetiche pluripotenti già disponibili presso il nostro laboratorio.a medium definiti e a specifiche concentrazioni di citochine che attivino i pathways di differenziamento mesenchimale.
b) di mantenere e stabilizzare le cellule per un periodo di coltura in sospensione e quindi di separarle mediante citometria a flusso in base all¿espressione di marcatori ematopoietici precoci di superficie quali CD45 e CD34 (Majumdar et al.,(2000)Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research. 9:841-848
c) di caratterizzare le cellule progenitrici ematopoietiche per la loro capacità di proliferare e di dare origine a colonie su supporto di metilcellulosa/medium in assenza di siero
d) di raccogliere le cellule al termine del periodo di coltura clonogenica, di separare e caratterizzarle per le diverse componenti eritroidi, linfoidi e mieloidi utilizzando specifiche colorazioni