Crioconservazione degli oociti felini immaturi mediante congelamento lento e vitrificazione.
Progetto DEFINIZIONE DEL TEMA DI RICERCA
Il limite nella crioconservazione degli oociti risiede nelle caratteristiche morfologiche e fisiologiche di queste cellule che ne determinano una particolare sensibilità ai cambiamenti di temperatura e di pressione osmotica extracellulare durante il congelamento. Questa sensibilità predispone a danni cellulari, come la disorganizzazione del citoscheletro (Vincent C. et al. J Reprod Fertil 1989;87:809-20; Vincent C. et al. Mol Reprod Dev 1990;26:227-35), il cui risultato è una scarsa sopravvivenza degli oociti scongelati. Inoltre lo stadio meiotico dell¿oocita influenza la sua resistenza al congelamento. I nostri precedenti studi hanno dimostrato che gli oociti maturi (Metafase II), dopo scongelamento e fecondazione in vitro, raggiungono tassi di sviluppo embrionale superiori a quelli ottenuti con gli oociti immaturi (stadio di vescicola germinale, GV; Luvoni GC, Pellizzari P. Theriogenology 2000;53:1529-40). Un¿ulteriore conferma della migliore crioconservabilità degli oociti maturi deriva da recenti prove di vitrificazione (Murakami et al. Cryobiology 2004;48:341-8) in cui gli oociti felini vitrificati si sono sviluppati fino allo stadio di blastocisti. Tuttavia, la crioconservazione degli oociti immaturi rappresenterebbe un¿importante strategia per la creazione di ¿banche genetiche¿ con importanti implicazioni nella riproduzione assistita dei carnivori domestici e selvatici.
OBIETTIVO
Lo scopo del presente progetto è lo studio dell¿effetto di due protocolli di crioconservazione (congelamento lento e vitrificazione in open pulled straws) sull¿organizzazione del citoscheletro e la competenza meiotica degli oociti felini allo stadio di GV.
PIANO SPERIMENTALE E METODOLOGIE
I complessi cumulo-oocita (COC) saranno raccolti da ovaie di gatte sottoposte ad interventi di comune sterilizzazione. I COC selezionati saranno divisi in tre gruppi dei quali: un gruppo conservato con congelamento lento seguendo il protocollo messo a punto nel nostro laboratorio (Luvoni GC, Pellizzari P. Theriogenology 2000;53:1529-40), un gruppo sottoposto a vitrificazione in open pulled straws (Vajta G. et al. Cryo-Lett 1997;18:191¿5) e un gruppo non congelato come controllo. Dopo scongelamento, saranno valutate: la distribuzione di tubulina, actina e l¿organizzazione cromatinica mediante immunolocalizzazione con tre fluorocromi diversi (Modina S, et al. Eur J Histochem 2004;48:337-46) e osservazione come ¿whole-mount¿ con un microscopio convenzionale a fluorescenza. I rimanenti oociti saranno sottoposti a maturazione in vitro e successiva colorazione con colorante fluorescente Hoechst 33342 per la valutazione dello stadio meiotico.
RISULTATI ATTESI
I risultati potranno evidenziare quale procedura sia in grado di preservare meglio la struttura dell¿oocita e la sua competenza meiotica dopo congelamento e di conseguenza contribuire alla definizione di un sistema ideale per la crioconservazione degli oociti felini allo stadio di GV.