La Famiglia multigenica GAS: esempio di specializzazione di ruoli nell'ambito dell'intero ciclo vitale del lievito Saccharomyces cerevisiae
Progetto Presupposti
Il nostro laboratorio studia il ruolo della famiglia multigenica GAS di lievito e PHR di Candida albicans, un importante lievito dimorfo responsabile di infezioni nell¿uomo, nella morfogenesi cellulare. Entrambe le famiglie sono costituite da 5 geni la cui espressione è finemente regolata durante diversi stadi dello sviluppo morfogenetico di questi organismi. Le proteine Gas/Phr sono dei promettenti bersagli per anti-fungini poiché la loro attività enzimatica è essenziale per l¿allungamento e il rimodellamento del glucano, il principale polisaccaride della parete che riveste una particolare importanza per il mantenimento dell¿integrità cellulare. E¿ noto, inoltre, che la mancanza di tale attività enzimatica determina in C. albicans una maggiore esposizione del glucano all¿interazione con le cellule del sistema immunitario e una piu¿ efficace risposta antinfiammatoria che si ritiene possa contribuire alla diminuita virulenza dei mutanti nulli phr in modelli animali di infezione fungina sistemica. Per questo motivo una parte degli studi del nostro laboratorio è anche dedicata allo studio funzionale e strutturale di questi enzimi.
Programma
I cinque geni di S. cerevisiae sono finemente regolati e piu¿ in particolare la coppia di geni GAS2-GAS4 è repressa durante la crescita vegetativa e indotta durante il processo di meiosi e sporulazione mentre la coppia GAS1-GAS5 ha un pattern di espressione inverso. Abbiamo dimostrato che GAS2 e GAS4 sono essenziali per lo sviluppo morfogenetico della parete della spora (risultati pubblicati su Euk.Cell 6, 302-316). Abbiamo in programma di studiare il ruolo del gene GAS3, che è espresso a livelli molto bassi in tutte le condizioni, e della coppia GAS1-GAS5 nel ciclo vitale di lievito. Gli esperimenti si articoleranno come segue:
- caratterizzazione del fenotipo di diploidi nulli gas3, gas1 e gas5 nel ceppo SK1 high-proficient per la meiosi e sporulazione.
- Tagging di tutte le proteine Gas con gli epitopi Myc, HA, Flag, Vps5 e His6 al fine di localizzare le proteine tramite immunofluorescenza indiretta e studiare eventuali cambiamenti durante diversi stadi di crescita e sviluppo.
- Tagging con tecniche di fusion protein (con GFP) per valutare l¿eventuale dinamica della localizzazione delle proteine Gas in cellule vive e a diversi stadi del ciclo vitale.
- determinazione della stabilità delle proteine Gas durante le transizioni crescita-sporulazione e viceversa, germinazione della spora-crescita, mediante esperimenti di marcatura pulse-chase delle proteine seguita da immunoprecipitazione con anticorpi specifici.
Obiettivo della ricerca è completare l¿analisi del ruolo dei singoli membri delle famiglie Gas e Phr al fine di capire il significato biologico della ridondanza di queste proteine e di integrare i risultati ottenuti con altri studi biochimici in corso su queste proteine che sono bersaglio promettente per inibitori della costruzione della parete fungina.