Cristallizzazione e analisi della struttura tridimensionale della protoglobina dell¿archea Methanosarcina acetivorans
Progetto Recentemente è stata identificata e caratterizzata una nuova famiglia di proteine a fold globinico, denominata ¿globin-coupled sensors¿, in grado di agire come sensori di ossigeno. Tali proteine, descritte inizialmente come regolatori delle risposte aerotattiche in Bacillus subtilis e Halobacterium salinarium, sono state successivamente identificate in altri microrganismi, dove agiscono come mediatori delle risposte cellulari a stimoli metabolici ed ambientali quali NO, CO e O2. Variazioni nella concentrazione intracellulare di tali gas viene percepita dal gruppo eme presente in tali sensori globinici ed ha ripercussioni nell¿aerotassi e nella regolazione genica. Il dominio sensore dell¿ossigeno (di tipo globinico o di tipo PAS) e¿ abbinato ad un dominio trasduttore di diversa natura/struttura. Un¿analisi filogenetica e funzionale ha suggerito che tutti i sensori a dominio globinico discendano da un comune ancestore, o protoglobina, la cui presenza è stata identificata in almeno due Archaea: Aeropyrum pernix e Methanosarcina acetivorans.
La ricerca FIRST qui presentata propone la cristallizzazione e la determinazione della struttura 3D del dominio globinico (160 a.a) di una protoglobina (195 a.a) di Archaea. In completa assenza di strutture 3D di protoglobine, siamo interessati a gettare luce sugli aspetti strutturali ed evoluzionistici di questa famiglia di globine ancestrali. Sulla base di una analisi delle sequenze disponibili per le protoglobine rispetto alle globine classiche (identità in sequenza inferiore al 20%) ci si può attendere una sostanziale modifica del fold globinico classico a 8 eliche.
Uno screening preliminare ha consentito di individuare almeno tre condizioni di cristallizzazione diverse in cui si formano monocristalli della protoglobina (ricombinante) di M. acetivorans adatti alla raccolta di dati di diffrazione. Intendiamo caratterizzare tali campioni cristallini utilizzando luce di sincrotrone, eseguendo sul campione che si rivelerà migliore in termini di qualità diffrattive, un esperimento di fasatura MAD (Multiple-wavelength Anomalous Dispersion). Tale esperimento, che consiste nell¿irraggiare il campione cristallino a lunghezze d¿onda prossime alla soglia di assorbimento X del ferro, consentirà di localizzare la posizione degli atomi di ferro del gruppo eme delle molecole proteiche presenti nella cella elementare, primo passo per calcolare una distribuzione di densità elettronica nell¿intorno dell¿eme in cui costruire il modello molecolare della protoglobina. Lo studio programmato fornirà le prime indicazioni sul fold delle protoglobine, sulla struttura del sito distale dell¿eme, oltre ad indicazioni evolutive più generali per la super-famiglia dell¿emoglobina. A struttura risolta, verranno inoltre correlate le proprietà funzionali di sensore dell¿ossigeno delle protoglobine (costanti di equilibrio e cinetiche per ligandi) con le proprietà strutturali.