VALUTAZIONE MOLECOLARE E CITOFLUORIMETRICA DELLA PROTEINA ZAP-70 NEI LINFOCITI CANINI: RUOLO COME MARKER PROGNOSTICO IN CORSO DI NEOPLASIE LINFOPROLIFERATIVE
Progetto ZAP-70 è una tirosin-chinasi associata alla catena zeta del TCR, coinvolta nell¿attivazione dei linfociti T e NK, ma recentemente evidenziata debolmente anche nelle cellule linfoidi B. Negli uomini con leucemia linfocitica cronica l¿espressione di ZAP-70 è inversamente correlata allo stato mutazionale delle immunoglobuline ed è correlata a prognosi sfavorevole. Nel cane ZAP-70 non è mai stata descritta ma sembra mostrare una elevata omologia con la specie umana. Scopo del progetto è: 1) valutare e quantificare l¿espressione di ZAP-70 nel cane in differenti tipi cellulari; 2) valutare la cross-reattività degli anticorpi utilizzati in medicina umana; 3) mettere a punto un protocollo citofluorimetrico per evidenziare e quantificare ZAP-70 nei linfociti normali; 4) valutare l¿espressione di ZAP-70 in neoplasie linfoidi a differente immunofenotipo; 5) valutare il potenziale prognostico della sua espressione in diverse neoplasie linfoidi canine.
Il disegno sperimentale prevede la valutazione delle sequenze dei geni codificanti per ZAP-70 nell¿uomo e nel cane disponibili in banca dati, per predirre la cross-reattività degli anticorpi disponibili e disegnare sonde di PCR in grado di riconoscere il c-DNA.
Gli anticorpi potenzialmente cross-reattivi verranno testati nel cane mediante western blotting su estratti di sangue periferico, PBMC, linfonodo, milza e timo. La presenza di una banda di circa 70 kd verrà considerata indicativa di cross-reattività. Sugli stessi tessuti e nei campioni neoplastici verrà evidenziato l¿mRNA specifico mediante RT-PCR, poi quantificato mediante real time PCR.
Verrà quindi approntato un protocollo citofluorimetrico a due colori che richiederà una prima marcatura degli antigeni di superficie linfocitari (T totali, T helper, T citotossici, B) seguita da permeabilizzazione e marcatura con l¿anticorpo anti ZAP-70, essendo questo intracitoplasmatico. La metodica permetterà di evidenziare e quantificare la proteina nelle differenti sottopopolazioni linfocitarie per poter poi paragonare le eventuali positività riscontrate in corso di leucemie linfoidi acute, linfomi, e leucemie linfoidi croniche nel cane. Quest¿ultima patologia, molto differente dall¿analoga forma umana in quanto generalmente caratterizzata da immunofenotipo T, risulta interessante da un punto di vista comparativo.
L¿espressione di ZAP-70 verrà poi correlata con i dati clinici e quelli derivanti dagli altri esami di laboratorio (citologia, immunofenotipo) e con i dati relativi alla sopravvivenza e alla risposta alla chemioterapia per valutare il suo potenziale prognostico, analogamente a quanto evidenziato in medicina umana. I risultati ottenuti potranno essere utili per l¿utilizzo di ZAP-70 come marker di alcune neoplasie linfoidi canine ed indicatore prognostico nonchè da un punto di vista comparativo alla luce del forte interesse nei confronti di tale proteina in oncoematologia umana e del cane come modello animale spontaneo delle neoplasie linfoidi umane.