Utilizzazione di fonti di carbonio aromatiche e stress ambientali: analisi funzionale del response regulator PprA di Pseudomonas putida

Presupposti I sistemi batterici per lo sfruttamento di fonti aromatiche di carbonio ed energia costituiscono un buon sistema modello sia per lo studio della modulazione nutrizionale che per la caratterizzazione della sua integrazione con gli stress ambientali. Tra i sistemi degradativi per composti aromatici, il più studiato, sia da un punto di vista enzimatico che regolativo, è senza dubbio quello coinvolto nella degradazione di toluene e m-/p-xilene codificato dal plasmide TOL pWW0 di Pseudomonas putida (1). Recentemente abbiamo identificato la proteina PprA per la sua capacità di legare il promotore Pu dell¿operone upper del sistema TOL. PprA ha le caratteristiche tipiche di un ¿response regulator¿ (RR) dei sistemi a due componenti, elementi molto diffusi di trasduzione di segnali ambientali (2). Normalmente ma non necessariamente, alterazioni dello stato di fosforilazione dei RR risulta in differenti profili di espressione genica. Descrizione ed obiettivo delle ricerca PprA possiede in posizione 54 un residuo di aspartato (D54) potenzialmente fosforilabile. Obbiettivo generale del progetto è la valutazione del ruolo della fosforilazione nella regolazione mediata da PprA. Questo obbiettivo sarà conseguito tenendo anche in considerazione il fatto che la proteina si ossida spontaneamente per formazione di un ponte disolfuro tra le uniche due cisteine presenti, una in posizione 70 (C70) e l¿altra in posizione 81 (C81). Questo evento di ossidazione, singolarmente o in relazione alla fosforilazione, potrebbe costituire un meccanismo di regolazione dell¿attività di PprA. Tale obbiettivo generale sarà conseguito attraverso lo svolgimento delle seguenti attività: 1) Costruzione in silico di un modello 3D di PprA e studio della dinamica molecolare in risposta a fosforilazione con particolare attenzione ai movimenti reciproci di C70 e C81. 2) Costruzione e saggio di mutanti di PprA nelle posizioni D54 C70 e C81. Verranno studiate ed effettuate sostituzioni di D54 in modo da prevenire la fosforilazione da un lato e dall¿altro mimare lo stato permanente di fosforilazione. Per quanto riguarda lo stato di ossidazione, C70 e C81 saranno sostituite da alanina. Inoltre verrà generato il doppio mutante C70A C81A. Tutti i mutanti generati saranno saggiati per la loro attività in vivo. 3) Monitoraggio dello stato di fosforilazione e di ossidazione di PprA in vivo. Lo stato di fosforilazione e di ossidazione di PprA verrà saggiata mediante caricamento di cellule intere su gel di poliacrilammide nativi, corsa elettroforetica, e procedura di Western blotting previa denaturazione delle proteine nel gel dopo la corsa. 1. Ramos, J. L., S. Marques, and K. N. Timmis. (1997). Annu.Rev.Microbiol. 51:341-373. 2. Stock, A. M., V. L. Robinson, and P. N. Goudreau. (2000). Annu.Rev.Biochem. 69:183-215.