I trasportatori del glutammato mediano la ricaptazione del neurotrasmettitore a livello della sinapsi, giocando così un ruolo essenziale nel controllo della durata dell¿evento sinaptico e prevenendo danni eccitotossici. Essi rappresentano perciò un importante target farmacologico.
Studi condotti negli ultimi anni hanno messo in evidenza come la loro attività ed espressione in superficie sia finemente modulata da proteine ad essi associate, ma solo alcune di queste proteine sono state fino ad oggi identificate.
Obiettivo della ricerca è individuare le proteine che interagiscono con il trasportatore del glutammato EAAC1 che media l¿assorbimento di amino acidi acidi a livello epiteliale e gioca un ruolo essenziale nel prevenire lo spillover di glutammato e l¿attivazione di recettori metabotropici a livello sinaptico.
Attraverso mutagenesi sito specifica abbiamo individuato nella regione carbossi terminale di EAAC1 sequenze consenso per l¿interazione con categorie di proteine quali quelle che mediano l¿endocitosi clatrina-dipendente e proteine PDZ, che vogliamo ora individuare. A tale proposito abbiamo costruito una proteina di fusione costituita da una coda di esa-istidine fusa in frame con la regione carbossi-terminale di EAAC1. Per mutagenesi sito specifica stiamo ora costruendo dei mutanti privi delle sequenze individuate. Intendiamo utilizzare questi costrutti in studi di cromatografia di affinità da effettuare con estratti cellulari provenienti da cellule epiteliali e neuronali. Un approccio alternativo sarà quello di effettuare esperimenti di co-immunoprecipitazione in linee epiteliali e neuronali che esprimono endogenamente il trasportatore EAAC1.
Eventuali proteine trattenute selettivamente da His-EAAC1 o presenti nell¿immunocomplesso verranno risolte attraverso SDS-PAGE e identificate per spettrometria di massa o tramite western blotting utilizzando anticorpi commerciali contro proteine PDZ note. Il ruolo delle proteine individuate nella localizzazione e/o attività del trasportatore verranno valutate tramite esperimenti di immunofluorescenza e uptake di amino acidi radioattivi.