Negli ultimi anni l¿incidenza di aspergillosi è aumentata per il continuo aumento di soggetti immunocompromessi: trapiantati (midollo osseo o organi), pazienti con neoplasie, leucemici e AIDS. La terapia prevede la somministrazione di amfotericina B, triazoli quali itraconazolo o voriconazolo e caspofungina, ciò nonostante il tasso di mortalità rimane alto. I fallimenti terapeutici possono essere attribuiti ad elevata tossicità del farmaco (amfotericina B), a fenomeni di resistenza e ovviamente allo stato immunitario del paziente.
La farmacoresistenza agli antifungini può essere primaria o secondaria. Mentre poco conosciuti sono i meccanismi molecolari della resistenza all¿amfotericina B, per gli azoli, in Aspergillus fumigatus, ne sono stati individuati alcuni quali:
diminuzione dell¿accumulo intracellulare del farmaco da overespressione di geni che codificano per pompe di efflusso
sostituzione di aminoacidi per mutazioni puntiformi in cyp51A (Aspergillus fumigatus) che codificano per la P-450 14a-demetilasi, bersaglio degli azoli.
Avendo individuato alcuni ceppi di Aspergillus fumigatus con scarsa sensibilità a itraconazolo (MIC pari a 16 mg/ml), li abbiamo analizzati per mutazioni puntiformi e, non avendone riscontrate, sottoposti a valutazione dell¿espressione del gene atrF. Neanche in questo caso si sono ottenuti risultati significativi.
Scopo di questa ricerca è quella di valutare l¿espressione del gene atrF dopo avere coltivato i ceppi in presenza di itraconazolo, e di analizzare l¿espressione delle ¿Multi Drug Resistance (MDR) pumps¿, sui ceppi coltivati in assenza e in presenza di itraconazolo.
Dai ceppi così coltivati sarà estratto RNA totale per una RT-PCR semiquantitativa. Tale indagine servirà preliminarmente a verificare quali geni, fra tutti quelli citati, mostreranno una overespressione significativa. Ottenuto questo dato, l¿espressione verrà analizzata con tecniche di Real -Time al fine di ottenere un¿analisi quantitativa strumentale che è noto non avere i limiti di una tecnica semiquantitativa la cui interpretazione non sempre risponde totalmente ai criteri di accuratezza, sensibilità e riproducibilità. Per procedere all¿analisi Real-Time si dovrà provvedere alla progettazione di una coppia di primers e di una sonda, specifici per ogni gene considerato.