Le NADPH-ferredossina riduttasi: studi del meccanismo catalitico mediante ingegneria proteica, cinetica rapida e cristallografia ai raggi-X
Progetto Esistono due sottoclassi strutturali di NADPH-ferredossina riduttasi (FNR, EC 1.18.1.2), i cui prototipi sono la FNR di tipo plastidico (presente anche negli Apicomplexa, tra cui Plasmodium falciparum) e la FNR di tipo mitocondriale (adrenodossina riduttasi, presente in alcuni batteri, quali Mycobacterium tuberculosis). L¿analisi cristallografica delle varie FNR ha messo in luce somiglianze e differenze nei siti attivi dei due tipi di riduttasi, suggerendo meccanismi molecolari sostanzialmente diversi nella catalisi della medesima reazione, consistente nel trasferimento dell¿idruro dal NADPH al gruppo prostetico FAD a dare FADH- e nel successivo trasferimento di un elettrone alla volta dal FADH- al centro Fe-S del substrato proteico ferredossina. Prendendo come enzimi-modello la FNR di radice di mais e la FprA di M. tuberculosis, di cui sono state ottenute le strutture cristallografiche ad altissima risoluzione (ca. 1 Å), verrà compiuta un¿analisi comparata del centro attivo dei due tipi di FNR mediante la combinazione di tecniche di ingegneria proteica, cristallografia ai raggi-X, studi di cinetica ed inibizione enzimatica. Si prevede di produrre una serie di varianti delle due proteine in cui residui localizzati nei rispettivi siti attivi siano stati sostituiti mediante mutagenesi sito-diretta. Le proprietà funzionali di tali mutanti saranno studiate allo scopo di identificare l¿effettivo coinvolgimento nel meccanismo catalitico dei residui in questione. Le caratteristiche catalitiche delle forme selvatiche e mutanti degli enzimi saranno studiate approfonditamente soprattutto mediante cinetica rapida utilizzando la tecniche della spettrofotometria stopped-flow. Nel caso della FNR di radice di mais in particolare saranno caratterizzati mutanti in cui è stata sostituita la tirosina C-terminale, nota per essere coinvolta in un processo di adattamento indotto a seguito del legame del substrato. Come osservato nel caso della FNR fotosintetica, tali mutazioni stabilizzano intermedi di reazione in modo da permetterne lo studio mediante difrattometria ai raggi-X. Questo progetto di ricerca, oltre a definire le caratteristiche geometriche e di distribuzione di carica dei siti attivi, può costituire la base per la progettazione di inibitori specifici con potenziali importanti ripercussioni nella ricerca di nuovi farmaci contro gravi patologie infettive.