Identificazione dei siti di legame per polinucleotide fosforilasi e proteina ribosomale S1 nella regione 5¿- non tradotta dell¿mRNA pnp di Escherichia coli
Progetto La polinucleotide fosforilasi (PNPasi, codificata da pnp) è una delle principali esoribonucleasi di E. coli. La PNPasi autoregola la propria espressione modulando la stabilità dell¿mRNA pnp con un meccanismo non ancora completamente chiarito. Abbiamo dimostrato che sia la PNPasi che la proteina ribosomale S1 legano in vitro la regione leader dell¿mRNA pnp. Esperimenti di mappatura mediante RNA footprinting hanno indicato un¿estesa sovrapposizione dei siti di legame di PNPasi e S1. Questi dati hanno suggerito che la competizione tra S1 e PNPasi per il legame a siti comuni possa regolare la stabilità/degradazione dell¿mRNA pnp. E¿ da notare che, in accordo col nostro modello, modulando la concentrazione intracellulare di S1 si osserva una corrispondente variazione dei livelli d¿espressione dell¿mRNA pnp.
Ci proponiamo di mappare i siti nella regione leader dell¿mRNA pnp richiesti per il controllo della stabilità di tale RNA da parte di PNPasi e S1. Mutanti puntiformi e per delezione nella regione leader dell¿mRNA pnp saranno costruiti per mutagenesi sito-diretta. Saranno mutagenizzati diversi elementi di struttura e di sequenza. In particolare, sostituzioni di base saranno fatte nella regione d¿inizio della traduzione e nelle regioni identificate in vitro come siti bersaglio per il legame di PNPasi e/o S1. Gli effetti di queste mutazioni sulla regolazione saranno saggiati analizzando l¿espressione di un gene reporter.
Da questi esperimenti ci aspettiamo una migliore comprensione dei meccanismi autoregolativi della PNPasi e in particolare di appurare quali siano i determinanti in cis nella regione leader di pnp richiesti per la stabilizazione-destabilizzazione dell¿mRNA pnp. Inoltre tali esperimenti potrebbero contribuire a chiarire se il ruolo di S1 in questo sistema si eserciti semplicemente antagonizzando il legame della PNPasi alla 5¿-UTR di pnp o se il legame dei ribosomi e l¿inizio della traduzione siano coinvolti nella stabilizzazione dell¿mRNA pnp.