Studio dell'interazione tra il dominio autoinibitorio della H+-ATPasi della membrana plasmatica di Arabidopsis thaliana e la proteina regolatrice PPI1
Progetto La ricerca rappresenta lo sviluppo di quella finanziata con fondi FIRST 2001-2005. L¿ obiettivo è la caratterizzazione di PPI1, una proteina che interagisce con il dominio autoinibitorio C-terminale (C-te) della H+ ATPasi della membrana plasmatica (PM) di A. thaliana (isoforma AHA1) stimolandone l¿attività catalitica. PPI1 attiva la H+ ATPasi in sinergia con altri fattori (pH acido o proteine 14-3-3). Il sito di legame di PPI1 nel C-te della H+ ATPasi è distinto da quello delle proteine 14-3-3 che coinvolge gli ultimi 3 aa della H+ ATPasi.
Ci si propone di caratterizzare nel dettaglio l¿interazione tra PPI1 e H+ ATPasi mediante analisi cristallografica del complesso PPI1-C-te di AHA1. Per lo scopo è indispensabile disporre di una quantità elevata e pura di entrambi i partner. La purificazione di PPI1, privo del dominio transmembrana C-te e fuso a 6His e prodotto in E. coli, messa a punto in laboratorio consente di produrre discrete quantità di proteina ma dovrà essere ottimizzata per aumentare la purezza e la concentrazione della proteina purificata. I tentativi di espressione in E. coli del C-te di AHA1 fuso alla proteina GST hanno portato alla produzione di frammenti proteolizzati della proteina. Verrà messo a punto un sistema di espressione del C-te di AHA1 in S. cerevisiae. Il cDNA codificante per gli ultimi 103 aa di AHA1 sarà inserito nel vettore pYES2 a valle del promotore pGAL. Il C-te di AHA1 sarà fuso alla sequenza codificante per la GST a valle di un sito di taglio per la trombina; la purificazione del C-te sarà effettuata tramite cromatografia di affinità su GSH-sefarosio a partire dalla frazione solubile estratta da lievito che esprime la fusione GST-CteAHA1. La quantità, l¿integrità e il grado di purezza della proteina purificata saranno saggiati dopo SDS-PAGE mediante colorazione con blu di coomassie e silver stain e dopo western blot con anticorpi specifici anti C-te e anti-GST.