Caratterizzazione strutturale di glucanosil-transferasi per un futuro loro impiego quali bersagli molecolari per nuovi antifungini

Basi Il beta(1,3)-glucano è il costituente principale della parete di lieviti e funghi. Nel patogeno Aspergillus fumigatus l¿attività beta(1,3)-glucanosiltransferasica è essenziale per l¿assemblaggio della parete. La medesima attività è presente in Saccharomyces cerevisiae (proteine Gas1-5) e in Candida albicans (proteine Phr) ma è assente nell¿uomo. Le glucanosiltransferasi appartengono alla famiglia GH72 [S1]. Hanno in comune il dominio catalitico, il cui ripiegamento predetto è TIM barrel, e due residui di acido glutammico che nei modelli si trovano a distanza compatibile con il proposto meccanismo catalitico [S1, S2, S3]. Tali residui sono essenziali per la catalisi. Il modulo Cys-Box è richiesto, assieme al dominio N-terminale, per l¿attività di questi enzimi (risultati presentati a ¿Candida and candidiasis¿ Denver (USA),13-17 March 2006 e manoscritto in preparazione). Nessuna struttura tridimensionale è disponibile. Programma Purificazione su larga scale delle proteine sGas1 e sGas2: Le proteine sono espresse via rDNA. Mappatura dei ponti disolfuro: in coll. con il Prof. De Jong verrà effettuata un¿analisi di MS sulle proteine sottoposte a frammentazione. Seguiranno esperimenti di mutagenesi sito specifica. Prove di cristallizzazione. Con il gruppo del Prof. Bolognesi si completeranno le prove sulla sGas1p deglicosilata, che hanno rilevato la formazione di pseudo-cristalli. sGas2p non è glicosilata e potrebbe essere piu¿ appropriata per la cristallizzazione. Si utilizzeranno preparazioni concentrate di sGas2p (10 mg/ml). Se i cristalli saranno di buona qualità si procederà alla loro esposizione ai raggi X Obiettivi Ottenere la struttura di glucanosiltransferasi per un futuro studio volto alla identificazione di inibitori S1. CAZy ¿ Carbohydrate Active enzyme; URL: : www.afb.cnrs-mrs.fr/CAZy/ S2.Conserved DomainDatabase,URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml S3. Protein Families Database of Alignments (Pfam) :