Modello in vitro per lo studio delle basi molecolari delle interazioni tra gameti negli insetti
Progetto PRESUPPOSTI. Le basi molecolari del riconoscimento uovo/spermatozoo negli insetti non sono noti. La mancanza d¿informazioni è dovuta soprattutto al fatto che i gameti degli insetti non si prestano alle consuete metodiche di fertilizzazione in vivo utilizzate per altri organismi. Noi abbiamo dimostrato la presenza nella membrana plasmatica dello spermatozoo di Drosophila melanogaster di glicosilasi simili a quelle che in altri organismi modello mediano le interazioni spermatozoo/superficie dell¿uovo, e la presenza sulla superficie dell¿uovo di numerose glicoproteine che sono potenziali ligandi degli enzimi dello spermatozoo. OBIETTIVO. In questo programma allestiremo un nuovo tipo di test in vitro per lo studio delle interazioni tra le superfici dei gameti degli insetti, utilizzando Drosophila come modello. DESCRIZIONE. 1) le glicosidasi di membrana dello spermatozoo saranno purificate, biotinilate e incubate con oociti. Il binding delle glicosidasi alla superficie dell¿uovo e la sua localizzazione saranno rivelati con incubazione in streptavidina coniugata a fluorocromi ed esame in microscopia in fluorescenza. 2) Le glicoproteine degli involucri dell¿uovo saranno purificate, blottate su membrane e fatte interagire con le glicosidasi biotinilate dello spermatozoo. Le glicoproteine che legano gli enzimi dello spermatozoo saranno identificate utilizzando streptavidina coniugata a perossidasi 3) La natura dei carboidrati delle glicoproteine di superficie della cellula uovo responsabili del binding uovo/spermatozoo sarà studiata utilizzando oligosaccaridi a struttura simile a quelli delle glicoproteine di superficie dell¿uovo e coniugati a biotina (OLS-B). OLS-B sono commercialmente disponibili. Sospensioni di spermatozoi saranno incubate con OLS-B e gli oligosaccaridi che interagiscono con la superficie degli spermatozoi saranno identificati trattando la sospensione di spermi con streptavidina coniugata a fluorocromi e con successivo esame in microscopia a fluorescenza.