Funzione delle proteine del locus UL131-128 del citomegalovirus umano come determinanti essenziali del tropismo del virus
Progetto Introduzione
Il citomegalovirus umano causa difetti congeniti, ed e' uno dei maggiori opportunisti negli stati di incompetenza immunitaria. HCMV infetta diversi tipi cellulari, tra cui cellule endoteliali (il principale sito di proliferazione e diffusione virale), monociti, cellule dendritiche, cellule epiteliali retiniche e polmonari.
Tre geni virali costituenti il locus UL131-128 sono stati da noi caratterizzati come determinanti essenziali del tropismo di HCMV per le cellule endoteliali. Il locus codifica tre proteine di natura secretoria. Abbiamo dimostrato che pUL130 e' un componente del virione.
Scopo della ricerca e' la definizione del ruolo delle proteine del locus nel generare virioni endoteliotropici. Lo approfondimento di questi aspetti fornira' informazioni utili per lo sviluppo di farmaci inibitori dello ingresso di HCMV in cellule importanti per la patogernesi. La caratterizzazione di proteine virali importanti nelle fasi iniziali del ciclo infettivo è fondamentale per lo sviluppo di vaccini.
Obiettivi Specifici
1) Definizione del blocco presente nei ceppi virali difettivi durante la penetrazione di HCMV in cellule endoteliali.
2) Uso del sistema a doppio ibrido in lievito (Y2HS) per la ricerca di partner proteici cellulari.
3) Espressione e purificazione di versioni ricombinanti delle proteine del locus per la generazione di anticorpi e per saggi di co-purificazione.
4) Utilizzo degli anticorpi prodotti per la verifica della presenza di pUL131 e pUL128 sui virioni e per saggi di co-immunopurificazione al fine di definire i complessi di cui le tre proteine fanno parte.
Materiali e metodi Western blotting, immunoprecipitazione ed immunofluorescenza con anticorpi specifici; sistema a doppio ibrido in lievito. Un sistema di knock-out/knock-in di bac-midi per creare ceppi di HCMV con mutazioni puntiformi in UL131-128. Il trasporto di chimere proteina virale-GFP verra' studiato mediante microscopia confocale.