GENERAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI CELLULE STAMINALI NEURALI UMANE (hNS) DA CELLULE STAMINALI EMBRIONALI (hES). Le cellule staminali embrionali umane (hES) sono state isolate per la prima volta nel 1998. La loro capacita' di auto-propagazione e di differenziamento per dare origine a tutte le cellule dell'organismo le rendono uno strumento affascinante sia per la ricerca di base che per il trapianto sperimentale, nonche' di interesse strategico in campo farmacologico e tossicologico. Il nostro laboratorio lavora con le linee cellulari denominate HES4 e H9 prodotte nel 2000 e nel 1998. Il loro uso e' in accordo con la legge 40/2004, che non esclude la ricerca sulle linee gia' derivate. Il Comitato Etico dell'Universita' di Milano ha espresso parere favorevole all'uso delle linee HES4 e H9 nel contesto dei Consorzi Europei EuroStemCell e ESTOOLS ai quali il nostro laboratorio partecipa.
Progetto L' obiettivo di questo progetto consiste nella generazione di cellule staminali neurali humane (hNS) a partire da hES. La speranza e' che sia possibile ottenere cellule hNS analoghe in quanto a espandibilita', stabilita' e omogeneita' alle Staminali Neurali di topo (mouse NS) che il nostro gruppo, insieme al gruppo di A. Smith (Edimburgo) ha ottenuto a partire dalle staminali embrionali di topo. Le cellule NS ottenute dalle embrionali di topo (mNS) sono clonali, in grado di automantenersi e di generare neuroni e glia. Esse possono essere trapiantate con successo e generare neuroni con specifiche caratteristiche regionali.
Le hES da cui si vuole partire sono caratterizzate per essere oct4+ve, ssea1-ve, ssea3+ve, ssea4+ve, tra1-60+ve e tra1-81+ve. Il loro tempo di duplicazione e' pari a 24 ore. Useremo protocolli di specificazione neurale in monostrato con l'obiettivo di ottenere una fonte propagabile di hNS dalle hES di cui sopra.
Caratterizzeremo le hNS mediante analisi di immunofluorescenza. Analogamente a quanto gia' visto con le mNS, le hNS in proliferazione dovrebbero risultare oct4-ve, nestin+ve, sox1-ve, sox2+ve, blbp+ve, vimentin+ve, GFAP-ve, and ?3-tubulin-ve e avere un cariotipo normale. Inoltre dovrebbero essere propagabili stabilmente per lungo tempo in vitro. Testeremo infine il loro potenziale differenziativo verso la produzione di neuroni GABAergici striatali usando appropriati protocolli di differenziamento ottimizzati dal nostro gruppo con le mNS. Si prevede l'analisi dell'espressione di marcatori di neuroni maturi come ad esempio NeuN, Map2, Tau, e di astrociti come GFAP e S100 oltre a caratteristiche neurofisiologiche specifiche quali il rilascio controllato di GABA). Il prodotto finale sara' una fonte permanente di cellule staminali umane neurali da cui ottenere neuroni umani per studi farmacologici, tossicologici e di trapianto sperimentale.