VALUTAZIONE DELLE VARIAZIONI CIRCADIANE DI INDICI DI TURNOVER OSSEO IN OSTEOBLASTI UMANI SINCRONIZZATI

Introduzione Le basi molecolari della periodicità circadiana coinvolgono un gruppo di clock genes che sono espressi con variazioni nelle 24 ore sia nel nucleo sovrachiasmatico dell¿ipotalamo che nei tessuti periferici. Clock genes sono espressi con variazioni circadiane anche in vitro, dopo aver sottoposto le cellule ad uno stimolo adeguato. E¿ possibile così definire modelli di cellule sincronizzate, da utilizzare per studi in vitro relativi alla periodicità circadiana delle attività cellulari. In vivo, il tessuto osseo è caratterizzato da un rimodellamento che presenta variazioni nelle 24 ore, con oscillazioni circadiane sia di markers di neoformazione che di riassorbimento. Nel tessuto osseo gli osteoblasti hanno un ruolo sia nella sintesi della matrice extracellulare che nella sua degradazione, regolata attraverso la sintesi di enzimi proteolitici. Tra questi, le metalloproteinasi ed i loro inibitori svolgono un¿attività controllata anche a livello di espressione genica che potrebbe essere modulata dai clock genes ed essere caratterizzata da variazioni circadiane. Materiali e metodi Colture primarie di osteoblasti umani verranno incubate in terreno di coltura 199 con il 20% di siero fetale bovino (FBS). Per ottenere la sincronizzazione delle cellule, 3 set di fiasche al 4° passaggio verranno sottoposte a shock sierico con l¿incubazione per 2 ore in terreno di coltura 199 con il 50% di FBS. Ogni 4 ore per 28 ore, verrà estratto l¿RNA totale dalle cellule di una fiasca per ciascuno dei 3 set. Per ogni campione verrà valutata mediante RT-PCR l¿espressione di clock genes (Per1 e Bmal1) e dell¿mRNA per il collagene 1, le metalloproteinasi (MMP-2 e MMP13) ed il loro inibitore TIMP-1. L¿analisi ritmometrica dei dati verrà effettuata con il metodo statistico del singolo cosinor. Obiettivo Valutazione della periodicità circadiana dell¿espressione di clock genes e di indici di turnover osseo in colture primarie di osteoblasti umani sincronizzati.