La Corea di Huntington (HD) è una malattia neurodegenerativa, genetica autosomica dominante causata dalla mutazione da espansione di triplette sul gene Huntingtina. Tale malattia è caratterizzata da depositi insolubili della proteina mutata e apoptosi neuronale. L¿obiettivo del progetto è quello di generare un modello animale di HD in zebrafish da utilizzare in un futuro progetto di screening di farmaci contro questa malattia. A tal fine, intendiamo manipolare embrioni di zebrafish inducendo l¿espressione di huntingtina mutata umana e analizzando la presenza di aggregati insolubili e morte cellulare per apoptosi.
1. Espressione dei frammenti mHTT in zebrafish.. Dopo un¿opportuna messa a punto del sistema, inietteremo nelle uova fecondate di zebrafish diversi costrutti disegnati per esprimere frammenti N-terminali della proteina huntingtina umana mutata. L¿obiettivo è quello di produrre grandi quantità di mHTT nelle prime fasi dello sviluppo embrionale. Per analizzare l¿espressione di mHTT negli embrioni iniettati useremo tecniche di PCR e ibridazione in situ. Saremo quindi in grado di generare degli embrioni di zebrafish che esprimono in maniera ubiquitaria frammenti della forma umana mutata di Huntingtina.
2. Analisi degli aggregati proteici. Valuteremo se i frammenti mHTT espressi in zebrafish formano aggregati insolubili e li quantificheremo attraverso tecniche di western blot e in situ immunolocalizzazione. Questi dati quantitativi e qualitativi ci permetteranno di verificare se anche in zebrafish i frammenti mHTT hanno la capacità di aggregarsi e di depositarsi nel cervello.
3. Analisi dell¿apoptosi. Ci proponiamo di analizzare l¿apoptosi negli embrioni che esprimono mHTT utilizzando un saggio TUNNEL sull¿embrione intero per individuare neuroni apoptotici. La tecnica ci sara¿ utile per individuare e quantizzare l¿apoptosi cerebrale e per confrontare la localizzazione nell¿embrione degli aggregati e delle cellule apoptotiche.