AN INTEGRATED PROTEOMIC AND ANALYTICAL APPROACH FOR ELUCIDATING THE MECHANISM OF ACTION OF HISTIDINE DIPEPTIDES AND SYNTHETIC DERIVATES
Tesi di Dottorato
Data di Pubblicazione:
2021
Citazione:
AN INTEGRATED PROTEOMIC AND ANALYTICAL APPROACH FOR ELUCIDATING THE MECHANISM OF ACTION OF HISTIDINE DIPEPTIDES AND SYNTHETIC DERIVATES / E. Gilardoni ; tutor: L. Regazzoni, G. Aldini ; coordinatore: G. Aldini. Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, 2021 Jan 13. 33. ciclo, Anno Accademico 2020. [10.13130/gilardoni-ettore_phd2021-01-13].
Abstract:
β-alanil-L-istidina (carnosina) è un peptide endogeno che possiede innumerevoli
proprietà (chelante dei metalli, antiossidante, sequestrante delle specie reattive
carboniliche). Diversi studi clinici hanno dimostrato un’attività farmacologica della
carnosina in malattie su base ossidative, tuttavia il meccanismo dell’attività in vivo
non è ancora noto. Questo progetto ha come scopo quello di comprendere il
meccanismo in vivo della carnosina. Per far ciò, sono stati sviluppati nuovi metodi
analitici di cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa per la
quantificazione in campioni biologici dei peptidi istidinici, loro derivati e gli addotti
con le specie reattive carboniliche.
Come prima cosa, un metodo analitico basato su una colonna ad interazione
idrofiliche è stato sviluppato per l’analisi del carnosinolo in matrici biologiche di
modelli animali di sindrome metabolica. La concentrazione di carnosinolo è stata
determinata in diversi tessuti e, per la prima volta, l’addotto carnosinolo-acroleina
è stato identificato in omogenato di fegato. Questo conferma l’attività del
carnosinolo e dei peptidi istidinici come sequestranti delle specie reattive
carboniliche in vivo. Tuttavia, è stata identificata l’instabilità metabolica
dell’addotto carnosinolo-HNE in diversi tessuti. Saranno quindi necessari ulteriori
studi per la caratterizzazione del metabolismo di questi addotti e l’identificazione
della corretta entità chimica da ricercare nelle matrici biologiche come indice
dell’attività sequestrante di carnosina e derivati.
Il metodo basato su colonne ad interazioni idrofiliche è stato anche utilizzato per
sviluppare un metodo a rivelazione diretta per determinare l’attività idrolitica del
siero umano della carnosina. La carnosinasi serica è stata identificata come
principale enzima impiegato nel metabolismo della carnosina. Rispetto ad altri
metodi pubblicati in letteratura, quello sviluppato in questo elaborato si basa su
una determinazione diretta della carnosina, senza dover effettuare processi
complessi di preparazione del campione. I dati ottenuti sono stati convalidati con
dati presenti in letteratura, dimostrando che il nostro metodo risulta essere
affidabile ed accurato. È stato possibile anche condurre esperimenti di
competizione fra substrati naturali e alcune molecole per valutare le principali
interazioni substrato/enzima, con l’obiettivo di identificare inibitori della
carnosinasi. I dati ottenuti sono stati condivisi con colleghi chimici computazionali
che attraverso esperimenti di docking, virtual screening e dinamica molecolare
hanno identificato dei possibili inibitori naturali della carnosinasi serica umana.
Un nuovo meccanismo d’azione della carnosina è stato approfondito, in quanto
recenti pubblicazioni hanno evidenziato un ruolo della carnosina nella prevenzione
della formazione di addotti fra la 3,4-diidrofenilglicolaldeide (DOPEGAL), un
metabolita intermedio del catabolismo della noradrenalina, e le proteine.
La capacità della carnosina di legare covalentemente la DOPEGAL tramite la
formazione di un prodotto di Amadori è stata determinata in vitro e in lisato
cellulare dove la DOPEGAL è stata formata aggiungendo noradrenalina al lisato
enzimaticamente attivo. Studi futuri dovranno caratterizzare la stabilità
metabolica di quest’addotto e le caratteristiche della sua formazione in matrici
biologiche in quanto risulta essere un interessante biomarcatore di tossicità
noradrenalinergica.
In fine è stata valutato l’impatto della carnosina e del carnosinolo sul proteoma di
cellule endoteliali umane derivanti dalla vena ombelicale. È ormai noto che i
farmaci non agiscono unicamente col meccanismo d’azio
Tipologia IRIS:
Tesi di dottorato
Keywords:
carnosine; reactive carbonyl species; carnosinol; dopegal; ADME; mechanism of action; HILIC; HNE; acrolein; histidine peptides; proteomics; carnosinase; mass spectrometry
Elenco autori:
E. Gilardoni
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