FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF A NOVEL GENETIC VARIANT PREDISPOSING TO ADVANCED FIBROSIS AND HEPATOCELLULAR CARCINOMA DEVELOPMENT IN NONALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE

Functional characterization of a novel genetic variant predisposing to advanced fibrosis and hepatocellular carcinoma development in nonalcoholic fatty liver disease Introduzione La steatosi epatica non alcoolica (NAFLD) rappresenta la più comune tra le malattie epatiche croniche nei paesi occidentali e rappresenta una causa emergente di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare (HCC). Numerosi studi hanno sottolineato l'importanza di vari tratti ereditari nel modificare la suscettibilità e il decorso di questa malattia. Tuttavia, la componente ereditabile di NAFLD resta in larga misura sconosciuta. Scopo dello studio Nell’ipotesi che una componente dell’ereditarietà della NFLD sia rappresentata da varianti genetiche rare con un forte impatto sull’attività proteica, il primo obiettivo di questo studio è stato quello di identificare, mediante Whole Exome Sequencing (WES), nuove varianti genetiche rare che determinassero un'alterazione dell'attività proteica e si associassero agli stadi avanzati della NAFLD. Abbiamo rilevato un'associazione tra una variante nel gene interferon regulatory factor 3 (IRF3) e lo sviluppo di carcinoma epatocellulare (HCC) correlato alla NAFLD. Abbiamo successivamente esaminato la regolazione specifica delle isoforme di IRF3 nei pazienti a rischio di NAFLD in relazione al danno epatico, abbiamo cercato di comprendere il ruolo di IRF3 nella biologia dell’epatocita e, infine, di mimare l'impatto della perdita di funzione dei trascritti alternativi di IRF3 sfruttando l'approccio di CRISPR/Cas9 genome editing in modelli in vitro. Infine, abbiamo testato l'impatto dell'inibizione della via di IRF3 sul tasso di proliferazione di cellule epatiche (HepG2) da parte dell'amlexanox. Quest’ultimo è un inibitore dell'asse TBK1-IRF3 in studio per il trattamento delle complicanze legate all'obesità.   Metodi e Pazienti • Abbiamo effettuato il sequenziamento dell'intero esoma (WES) di 72 pazienti NAFLD-HCC italiani e 50 individui sani. I pazienti HCC sono stati confrontati con la popolazione europea (Europei non finlandesi inclusi nell’ Exome Aggregation Consortium, N = 33,370). • Le associazioni sono state validate in un altro gruppo di pazienti con HCC correlato a NAFLD (N = 105), in 211 pazienti con fibrosi avanzata (N = 211) e altri 270 individui Italiani sani. Inoltre, è stato utilizzato un database più ampio per valutare la popolazione europea (genome aggreagation consortium, N = 64.603). • Sono state eseguite analisi trascrittomiche su 125 soggetti gravemente obesi (coorte trascrittomica) sottoposti a biopsia epatica percutanea eseguita durante un intervento chirurgico bariatrico. L'RNA-Seq è stato eseguito su RNA estratto da biopsie epatiche congelate rapidamente. • Per valutare l'effetto di IRF3-CL è stata introdotta una variante somatica nell'accettore di splicing dell’esone 7 specifico di IRF3-CL. In breve, abbiamo generato una linea di cellule HepG2 esprimente Cas9 sotto il controllo di un promotore inducibile da dxiciclina usando vettori lentivirali (Dharmacon, Lafayette, U.S.A.). L’RNA guida specifico è stato disegnato utilizzando il CRISPR design tool (http://crispr.mit.edu/) e clonato in un vettore di espressione (Addgene # 51133). Infine, le cellule trattate con doxiciclina sono state trasfettate con il vettore di espressione. Popolazioni clonali derivate da singole cellule sono state ottenute con il metodo della diluizione limite. In seguito, la presenza di mutazioni nel locus specificato è stata studiata mediante test nucleasi T7 (New England Biolabs, Ipswich, USA) e ulteriormente confermata con sequenziamento diretto (metodo di Sanger).   Risultati La variante IRF3 rs141490768 è risultata più frequente nel gruppo di pazienti con HCC rispetto a