GENERATION OF AUTHENTIC HUMAN NEOCORTICAL NEURONS FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS TO INVESTIGATE 7Q11.23 GENE DOSAGE IMBALANCES

Questo lavoro di tesi ha avuto lo scopo di studiare lo sviluppo della neocorteccia umana ed i meccanisimi alla base della sua compromissione che risultano nell’insorgenza di patologie del neurosviluppo mediante un’analisi dei profili trascrizionali e della morfologia di neuroni neocorticali umani generati a partire da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). Data l’importanza di basarsi su un paradigma di neurogenesi in vitro riproducibile e affidabile nel generare neuroni neocoritcali umani autentici, prima di adottare questo sistema modello per lo studio di patologie del neurosviluppo, nella prima fase di questa ricerca abbiamo eseguito un’ampia caratterizzazione trascrizionale, molecolare e funzionale del protocollo di differenziamento. Le dinamiche trascrizionali che regolano il neurosviluppo in vitro sono state studiate effettuando esperimenti di RNA-sequencing sia a livello di popolazione che di singola cellula. In combinazione con diverse analisi bioinformatiche tra cui l’analisi delle componeti principali (PCA), l’analisi dei geni differenzialemtne espressi e l’analisi WGCNA. L’analisi dei profili trascrizionali è stata accompagnata da un’ampia analisi di d’immunocitochimica che ha permesso di confermare l’identità e lo stadio di sviluppo delle cellule in coltura. Inoltre, la maturità funzionale dei neuroni derivati da iPSCs è stata ulteriormente confermata dalla loro capacità di generare potenziali d’azione, sostenere pattern di scarica complessi e sviluppare attività sinaptica spontanea eccitatoria ed inibitoria. Complessivamente, i risultati ottenuti da questo ampio e diversificato pannello di analisi hanno permesso di stabilitre la riproducibilità del protocollo di differenziamento e la sua competenza nel generare con elevata efficienza principalmente neuroni neocorticali autentici. Successivamente abbiamo applicato questo protocollo di differenziamento neocorticale come sistema modello per studiare due patologie del neurosviluppo dovute alla delezione e duplicazione di una regione comprendente circa 1.5 - 1.8 Mb (megabasi) collacata sul braccio lungo (q) del cormosoma 7 nella banda 11.23. Duplicazioni e delezioni di questa regione sono di particolare interesse in quanto le due sindromi che ne risultano, rispettivamente la sindrome di Willams (WS) e la sindrome da duplicazione 7q11.23 (7q11DUP), presentano fenotipi cognitivi e comportamentali caratterizzati da profili simili e tratti simmetricamente opposti. La frequente comorbidità della sindrome da duplicazione 7q11.23 con altre patologie del neurosviluppo come l’autismo e la schizofrenia in contrasto con la sindrome di Williams che è una sindrome ben caraterizzata non associata ad altre patologie del neurosviluppo, rende lo studio dell’ alterato dosaggio genico del locus 7q11.23 estremamente interessante per identificare con precisione i meccanismi molecolari caratteristici di ciascuna condizione clinica, condivisi da entrabme le sindromi e comuni anche ad altre patologie del neurosviluppo. A questo scopo, abbiamo generato diverse linee di iPS a partire da un ampio gruppo di individui, comprendente individui sani e pazienti affetti dalla sindrome di Williams (WS) e dalla sindrome di duplizazione 7q11.23, che sono poi state differenziate in neuroni neocorticali applicando il protocollo precedentemetne caraterizzato. Confermata l’identità e l’autenticità dei neuroni neocorticali generati da iPSCs, stiamo attualmente identificando i geni ed i meccanismi molecolari disregolati in specifici sottotipi di neuroni che abbiano la maggior rilvenza clinica. Inoltre, l’analisi morfologica dei neuroni neocorticali umani ottenuti da pazienti WS e soggetti sani ha permesso di confermare nell’uomo molte alterazioni morfolog