STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF COMPLEMENT FACTOR H: A CRUCIAL PROTEIN IN SEVERAL DISORDERS
Tesi di Dottorato
Data di Pubblicazione:
2015
Citazione:
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF COMPLEMENT FACTOR H: A CRUCIAL PROTEIN IN SEVERAL DISORDERS / S. Berra ; tutor: A. Clivio ; coordinator: M. Clerici. DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE E CLINICHE "L. SACCO", 2015 Jan 20. 27. ciclo, Anno Accademico 2014. [10.13130/s-berra_phd2015-01-20].
Abstract:
Il Fattore H del complemento (FH) è un importante regolatore della via alternativa del complemento: protegge infatti le cellule dell’ospite dall’attacco del sistema del complemento e carenze di FH sia qualitative e quantitative dovute a mutazioni nel gene CFH sono spesso associate ad una serie di malattie umane, come la glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN), la sindrome emolitico-uremica atipica (aHUS) e la degenerazione maculare della retina legata all’età (AMD).
Mentre esiste una caratterizzazione genetica per tutte queste malattie, i dati funzionali a livello di proteine sono spesso carenti.
Inoltre, il FH gioca un ruolo significativo nelle malattie infettive: molti agenti patogeni sono infatti in grado di reclutare il FH sulla loro superficie sfruttandolo per proteggersi dagli attacchi del complemento. Mentre per alcuni agenti patogeni l'interazione con il FH è stata ben descritta, per gli altri gli "interattori" diretti sono ancora sconosciuti.
Tuttavia, lo studio del FH è complicato dalla presenza di proteine FH-related (FHRs) che posseggono un elevato grado di somiglianza con il FH e ne rendono quindi difficile la purificazione e la analisi diretta.
Il primo obiettivo di questo progetto è stato lo sviluppo di saggi quantitativi e funzionali FH-specifici, utilizzando un anticorpo monoclonale (Mab 5H5) prodotto nel nostro laboratorio, che si è dimostrato essere specifico per FH. Il secondo era la produzione del FH intero e di tre frammenti, contenenti diverse porzioni della proteina, sia in un sistema di espressione eucariotico che procariotico.
L’anticorpo 5H5 è stato prodotto in grandi quantità utilizzando un mini-fermentatore ed è stato utilizzato per purificare il FH mediante cromatografia di affinità. La purezza e l’attività funzionale del FH purificato sono state valutate e confrontate con gli altri metodi di purificazione (ad es. affinità su Eparina, HPLC, HIC). È stato inoltre sviluppato un test ELISA per la corretta quantificazione del FH da fluidi biologici, utilizzando il 5H5 insieme ad un anticorpo policlonale anti-FH, anch’esso prodotto nel nostro laboratorio, e al FH purificato per affinità. Questo test di quantificazione è risultato affidabile ed è stato utilizzato per valutare diversi campioni di pazienti aHUS e AMD.
Inoltre, sono stati sviluppati anche due micro-metodi di purificazione del FH. Questi metodi consentono di purificare una buona quantità di FH altamente purificato partendo da una piccola quantità di campione e sono quindi uno strumento utile per studiare il FH specialmente in quelle patologie, quali aHUS, che colpiscono soprattutto i bambini.
Infine, sono stati sviluppati due saggi funzionali per valutare sia l'attività cofattoriale N-terminale che l’attività protettiva C-terminale del FH. Il FH è una grossa glicoproteina solubile che possiede funzioni diverse in differenti parti della molecola. Quindi diversi test sono necessari per valutare la completa funzionalità del FH.
Il primo test, il "cofactor assay", basato sul fatto che il FH possiede attività cofattoriale per il taglio del C3b mediato dal FI, è completamente funzionante ed è già stato utilizzato per lo screening di diversi campioni.
Il secondo, il test di emolisi, si basa sul fatto che il FH è in grado di proteggere gli eritrociti di pecora dalla emolisi mediata dal complemento. In questo test il FH purificato dai pazienti verrà utilizzato insieme ad un siero di controllo depleto di FH, al fine di avere un saggio in cui l'unica variabile sia il FH. Questo test è stato già messo a punto utilizzando un siero di controllo al fine di verificare tutte le condizioni, ed è ora nella fase finale di sviluppo, dopo di che sarà utilizzabile su materiale dei pazienti.
I quattro cloni
Tipologia IRIS:
Tesi di dottorato
Elenco autori:
S. Berra
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