SVILUPPO DI METODI IFENATI ASSOCIATI ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI: APPLICAZIONI PROTEOMICHE E GLICOSFINGOLIPIDOMICHE.
Tesi di Dottorato
Data di Pubblicazione:
2014
Citazione:
SVILUPPO DI METODI IFENATI ASSOCIATI ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI: APPLICAZIONI PROTEOMICHE E GLICOSFINGOLIPIDOMICHE / E. Torretta ; tutor: C. Gelfi; coordinatore: M.S. Clerici. DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE PER LA SALUTE, 2014 Feb 04. 26. ciclo, Anno Accademico 2013. [10.13130/torretta-enrica_phd2014-02-04].
Abstract:
L’interesse per lo sviluppo di nuovi metodi e per l’applicazione di tecniche ifenate è
generato dalla necessità di caratterizzare campioni biologici complessi. Questo
lavoro affronta l’applicazione e la messa a punto di tecniche ifenate allo scopo di:
a) identificare un nuovo biomarcatore da associare al PSA (Prostate Specific
Antigen) per la diagnostica del cancro prostatico, b) sviluppare una nuova tecnica
ifenata per l’analisi di glicosfingolipidi.
Negli studi di proteomica clinica, destinati all’identificazione di nuovi biomarcatori, i
maggiori problemi sono legati all’incompatibilità dell’intervallo di sensibilità degli
strumenti di rivelazione con l’intervallo di concentrazione delle specie proteiche e
peptidiche presenti nei fluidi biologici. Pertanto, poiché l’intervallo di sensibilità
degli strumenti di rivelazione non può essere variato, il passaggio cruciale è
rappresentato dalla riduzione dell’intervallo di concentrazione tra le specie più
abbondanti e le specie meno abbondanti nei fluidi biologici in esame. Nel caso del
siero ciò è stato ottenuto grazie all’eliminazione della frazione contenente le
proteine a maggior abbondanza mediante immunodeplezione selettiva. Le frazioni
seriche a bassa abbondanza preparate da 30 pazienti affetti da cancro alla
prostata (ADK) e da 30 soggetti controllo sono state analizzate tramite MALDI
profiling. La metodica applicata ha permesso di individuare delle differenze
statisticamente significative nell’espressione di alcune componenti proteiche,
rivelate dalla presenza di picchi differenzialmente espressi negli spettri di massa
ottenuti. Tuttavia, il punto fondamentale per il trasferimento dei risultati ottenuti in
diagnostica clinica è rappresentato dall’identificazione delle specie proteiche
contenute nel profilo di massa MALDI al fine di poter utilizzare tecniche
immunometriche per la validazione dei dati e sviluppare metodi di dosaggio su
larga scala applicabili in diagnostica clinica. Grazie all’ifenazione tra tecniche
cromatografiche, quali la cromatogafia per gel filtrazione e la cromatografia a fase
inversa, condotte rispettivamente su uno strumento HPLC e su uno strumento
nano LC, e tecniche di spettrometria di massa MALDI, è stato possibile identificare
il picco 2021 m/z, statisticamente variato, che corrisponde al peptide C3f, derivato
dalla proteolisi del fattore del complemento C3, e la sua aumentata espressione in
pazienti ADK+ a bassi valori di PSA, è stata confermata attraverso un esperimento
di immunoblotting. I risultati sono stati validati su un secondo gruppo di pazienti e
controlli. L’aumento di tale peptide indica una deregolazione del fattore del
complemento C3 che viene inattivato a iC3b, il quale inibisce il ciclo della via
alternativa del sistema del complemento impedendo l’associazione del fattore C3b
al fattore B. Il peptide C3f potrebbe pertanto essere usato in associazione con il
valore serico di PSA per ridurre il numero di pazienti “falsi negativi”.
Un altro aspetto importante della ricerca biomedica e indirettamente della
diagnostica clinica è rappresentato da una classe di molecole di segnale che si
sono rivelate importanti in numerose patologie quali malattie cardiovascolari e
neurodegenerative, tumori, malattie d’accumulo lisosomiale e sindrome
metabolica. Nonostante il crescente interesse clinico, l’analisi dei glicosfingolipidi
non gode di tecnologie ad alta automazione che permettano una facile
identificazione e quantizzazione di specie con pesi molecolari spesso molto simili.
Attualmente tale caratterizzazione avviene tramite l’utilizzo di precursori radioattivi,
oppure di coloranti che non permettono una quantizzazione precisa, o di metodi
III
Tipologia IRIS:
Tesi di dottorato
Elenco autori:
E. Torretta
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