Data di Pubblicazione:
2014
Citazione:
TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF THE B3GALT5 GENE / A. Zulueta Morales ; tutore: R. Ghidoni ; co-tutore: M. Trinchera ; direttore del dottorato: M. Clerici. DIPARTIMENTO DI SCIENZE DELLA SALUTE, 2014 Jan 27. 26. ciclo, Anno Accademico 2013. [10.13130/zulueta-morales-aida_phd2014-01-27].
Abstract:
RIASSUNTO
Introduzione. La β1,3 galattosiltransferasi (B3GALT5) è responsabile della sintesi della catena oligosaccaridica di tipo 1, tra cui gli antigeni Lewis come il sialil-Lewis a, epitope del marcatore tumorale CA19.9 e ligando della E-selectina, potenzialmente coinvolto nella malignità tumorale. La sua trascrizione è regolata da molteplici promotori. In alcuni epiteli essa è sotto il controllo di un promotore debole, chiamato nativo, modulato epigeneticamente e tramite il fattore nucleare NF-Y. In alcuni organi e cellule di origine gastrointestinale è attivo inoltre un altro promotore, più forte e chiamato LTR per la sua origine retrovirale, che secondo la letteratura dovrebbe essere regolato attraverso il fattore nucleare epatocitario HNF1α/β e quello analogo al Caudale di drosofila Cdx1/2. Tuttavia la B3GALT5 è repressa nel cancro del colon, il trascritto LTR non è rilevante nell’intestino tenue, e Cdx1/2 risultano assenti in una linea cellulare che esprime grandi quantità di tale trascritto.
Scopi. Scoprire i meccanismi che controllano la trascrizione di B3GALT5 attraverso il suo promotore LTR, con l’obiettivo di spiegare la specificità tissutale e la repressione negli adenocarcinomi del colon, nonché di capire il processo di stabilizzazione evolutiva del trasposone in alcuni primati.
Metodi. A questo scopo abbiamo quantificato l’espressione di HNF1α/β e Cdx1/2, tramite Western Blot, e quella del trascritto B3GALT5 LTR, tramite RT-PCR competitiva, in tessuti tumorali e linee cellulari. Inoltre, abbiamo silenziato HNF1α o β in diverse cellule, tramite shRNA, e li abbiamo espressi in un’altra, tramite trasfezione del cDNA. Abbiamo quindi trattato delle cellule con l'agente demetilante il DNA 5'-AZA-2'-desossicitidina, misurandone poi i livelli di trascritto LTR. Abbiamo infine valutato il promotore LTR in vitro, mediante saggi di EMSA e di luciferasi. Risultati. Cdx1/2 risultano immisurabili in cellule e tessuti che pur esprimono alti livelli di trascritto LTR, mentre HNF1α/β sono presenti anche in cellule e tumori che esprimono una quantità bassa o nulla del trascritto. Nelle cellule che non esprimono HNF1α/β però non c’è espressione alcuna del trascritto LTR. Tra queste, le MDA-MB-231, dopo transfezione con HNF1α o β, esprimono il trascritto LTR, ma a bassi livelli, paragonabili a quelli dei tumori del colon. Il silenziamento di HNF1α in una linea cellulare che esprime entrambi i fattori HNF1α e β non ha effetti nell’espressione del trascritto LTR, mentre quello di HNF1β in un’altra linea che esprime solo HNF1β produce forte riduzione del trascritto. Pure il trattamento con 5'-AZA-2'-desossicitidina riduce il trascritto in cellule che ne esprimono alti livelli, portandolo ai livelli dei tumori del colon, e senza effetto sulla quantità di HNF1. Usando i saggi delle luciferasi, abbiamo visto che la luciferasi sotto il controllo del promotore LTR è più attiva in cellule e cloni che esprimono alte quantità di HNF1, anche se non esprimono o esprimono poco trascritto LTR, che in quelle cellule che esprimono poco HNF1 ma magari una grande quantità di trascritto. Usando la sequenza del promotore LTR in saggi di EMSA, abbiamo visto che forma dei complessi specifici con estratti di proteine nucleari di tutte le linee cellulari che esprimono HNF1, indipendentemente dei livelli di espressione del trascritto B3GALT5 LTR.
Conclusione. I nostri risultati suggeriscono che HNF1α e -β sono necessari ma non sufficienti a regolare l'espressione del promotore LTR, mentre Cdx1/2 non sono coinvolti. HNF1α/β svolgono un ruolo intercambiabile e non cumulativo, e non sono immediatamente responsabili della regolazione negativa che avviene nel cancro, che invece dipende da elementi regolator
Tipologia IRIS:
Tesi di dottorato
Keywords:
hepatocyte nuclear factor 1 ; colon cancer ; type 1 chain carbohydrates ; transposon
Elenco autori:
A. ZULUETA MORALES
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