Immortalizzazione reversibile e trasduzione di mesoangioblastidmd con un cromosoma artificiale esprimente la distrofina per la terapia cellulare della distrofia muscolare
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Data di Pubblicazione:
2013
Citazione:
Immortalizzazione reversibile e trasduzione di mesoangioblastidmd con un cromosoma artificiale esprimente la distrofina per la terapia cellulare della distrofia muscolare / S. Benedetti, F.S. Tedesco, H. Hoshiya, G. D’Antona, M. Gerli, M. Ragazzi, K. Yasushiro, R. Tonlorenzi, S. Chaouch, A. Lombardo, S. Antonini, C. Gargioli Cesare, L. Naldini Luigi, Y. Torrente, R. Bottinelli, G. Messina, M. Oshimura, G. Cossu. ((Intervento presentato al 17. convegno Convention Scientifica Fondazione Telethon tenutosi a Riva del Garda, TN nel 2013.
Abstract:
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia genetica,
causata dall’assenza della proteina distrofina, che causa un progressivo
deterioramento del tessuto muscolare scheletrico. Questo progetto
si propone di sviluppare un nuovo approccio di terapia cellulare
autologo per la DMD, basato sul trapianto di mesoangioblasti (MABs,
progenitori associati ai vasi) umani distrofici, il cui difetto genetico
sia stato precedentemente corretto con un cromosoma artificiale
umano (HAC) contenente l’intero locus della distrofina (DYS-HAC).
Gli HACs presentano diversi vantaggi rispetto ai vettori normalmente
impiegati nella terapia genica, tra cui il mantenimento in forma episomale
e la capacità di contenere intere regioni geniche comprensive
di elementi regolatori. Recentemente abbiamo dimostrato l’efficacia
di trasferimento del DYS-HAC in MABs murini distrofici (mdx(DYSHAC)
MABs). Gli mdx(DYS-HAC)MABs si sono mostrati in grado di colonizzare
efficacemente il muscolo scheletrico di topi distrofici, producendo
un considerevole numero di fibre esprimenti la distrofina le
quali hanno permesso un significativo e stabile miglioramento
morfologico e funzionale del fenotipo distrofico (Tedesco et al. Sci.
trasl. Med. 2011). L’estensione di questo protocollo a mesoangioblasti
umani (hMABs) non è direttamente possibile poichè in coltura i
hMABs entrerebbero in senescenza dopo la selezione necessaria per
isolare le cellule in cui il DYS-HAC è stato tarsferito. È necessario
pertanto un processo di immortalizzazione reversibile che è stato ottenuto
mediante trasduzione con vettori lentivirali “floxati” esprimenti
hTERT(iresHSV1-TK) e Bmi-1(iresHSV1-TK), per impedire rispettivamentemte
l’accorciamento dei telomeri e l’azione anti-proliferativa
di p16. Popolazioni policlonali e clonali sono state selezionate
per l’espressione di hTERT e Bmi-1 e quindi caratterizzate per la
capacità proliferativa, la non tumorigenicità e il potenziale miogenico
in vitro. In seguito la stessa strategia è stata adottata per immortalizzare
i hMABs distrofici (DMD hMABs) prima del trasferimento di un
nuovo DYS-HAC privato di transgeni immunogenici (DYS-HAC2). Dal
trasferimento del DYS-HAC2 sono stati ottenuti cloni in cui la presenza
dell’HAC è stata confermata sia per PCR sia per FISH. Al momento
stiamo testando la reversibilità dell’immortalizzazione, tramite
l’utilizzo di un lentivirus non integrante esprimente la Cre ricombinasi,
e la potenzialità di tali cloni di colonizzare il muscolo scheletrico
distrofico formando fibre esprimenti la distrofina
Tipologia IRIS:
14 - Intervento a convegno non pubblicato
Elenco autori:
S. Benedetti, F.S. Tedesco, H. Hoshiya, G. D’Antona, M. Gerli, M. Ragazzi, K. Yasushiro, R. Tonlorenzi, S. Chaouch, A. Lombardo, S. Antonini, C. Gargioli Cesare, L. Naldini Luigi, Y. Torrente, R. Bottinelli, G. Messina, M. Oshimura, G. Cossu
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