DEFINITION OF AN IN VITRO MODEL OF HUMAN MONOCYTE ACTIVATION REPRESENTATIVE OF THE DEFENSIVE INFLAMMATORY RESPONSE

La reazione di difesa innata/infiammatoria è attivata in risposta a patogeni esterni o a segnali provenienti dal tessuto danneggiato. I monociti/macrofagi hanno un ruolo chiave nell’inizio e risoluzione della infiammazione per mezzo di differenti programmi di attivazione. Infatti i macrofagi possono adottare in vivo una varietà di fenotipi diversi che dipendono dai cambiamenti del microambiente tissutale, esibendo un continuum di stati funzionali diversi. Inoltre i monociti del sangue periferico non sono una popolazione omogenea ma differiscono nei loro fenotipi e funzioni. Nonostante l’esplosivo aumento di informazioni sull’argomento, molte questioni sono ancora aperte riguardo la caratterizzazione fenotipica e funzionale dei monociti/macrofagi, e il loro ruolo durante l’omeostasi e l’infiammazione. La maggior parte dei dati provengono da studi sul topo e molti immunologi fanno ancora affidamento su modelli di topo malgrado la distanza evolutiva e le differenze tra i sistemi immuni murino e umano. Nel tentativo di capire le questioni di cui sopra e di dirigere gli sforzi verso una immunobiologia basata sull’uomo, il fine di questo lavoro è stato quello di costruire e validare un modello umano della risposta di difesa innata/infiammatoria in vitro che ricapitolasse le differenti fasi della reazione infiammatoria, dal reclutamento e inizio, allo sviluppo e risoluzione dell’infiammazione e conseguente ripristino della omeostasi. Il modello è basato su monociti umani primari del sangue esposti in coltura a cambiamenti sequenziali delle condizioni microambientali (chemiochine, citochine, temperatura, molecole di derivazione batterica, ecc.) per 48 h. L’analisi al citofluorimetro ha dimostrato che la popolazione monocitaria utilizzata era rappresentativa dell’eterogeneità monocitaria così come presente nella circolazione sanguigna. Tutte le fasi della risposta infiammatoria sono state definite mediante analisi trascrittomica effettuata con U133Plus 2.0 GeneChip (Affymetrix). I risultati sono stati confrontati e integrati con profili trascrizionali pubblicamente disponibili di monociti/macrofagi, raccolti e annotati in un database ad hoc. Il profilo trascrittomico di alcuni fattori trascrizionali e fattori correlati con l’infiammazione sono stati confermati e validati mediante qPCR e ELISA. La “cluster analysis” ha rivelato cluster ampi e distinti che comprendono geni con un chiaro andamento che ben descrivono le differenti fasi dell’infiammazione. Per ottenere maggiori indicazioni sul ruolo biologico dei geni differenzialmente espressi durante la risposta infammatoria, ciascun cluster è stato analizzato con la GSEA (Gene Set Enrichment Analysis). I set di geni identificati dalla GSEA correlati con il profilo di espressione dei differenti cluster ha rivelato che la fase infiammatoria era arricchita di pathway infiammatorie mentre la fase anti-infiammatoria, così come quella di risoluzione, di pathway relative al metabolismo, al ciclo cellulare e al riarrangiamento genico. Inoltre confrontando le liste dei geni differenzialmente espressi tra monociti e macrofagi M1 e tra monociti e macrofagi M2 estratte dal meta-database, è stato dimostrato che i monociti trattati in vitro secondo il modello mostrano un profilo M1 durante la fase infiammatoria e M2 durante la risoluzione. L’espressione genica dei fattori trascrizionali e di quelli relativi alla infiammazione rispecchiavano il profilo di espressione ottenuto con microarray. In conclusione i dati di microarray e l’analisi cinetica dei fattori infiammatori e anti-infiammatori validano il modello in vitro proposto, modello che consente di descrivere la sequenza tempo-dipendente e coordinata degli eventi relativi alla infiammazione.