UNDERSTANDING THE PRO-SURVIVAL ROLE OF AIF: STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STUDY OF AIF-CHCHD4 COMPLEX
Tesi di Dottorato
Data di Pubblicazione:
2024
Citazione:
UNDERSTANDING THE PRO-SURVIVAL ROLE OF AIF: STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STUDY OF AIF-CHCHD4 COMPLEX / E. Fagnani ; tutor: A. Aliverti ; co-tutor: M. Milani ; coordinatore del dottorato: R. Mantovani. Dipartimento di Bioscienze, 2024. 36. ciclo, Anno Accademico 2022/2023.
Abstract:
Il fattore di induzione dell’apoptosi (AIF), una flavoproteina mitocondriale altamente conservata, è generalmente noto per il suo ruolo nell’attivazione del processo di apoptosi intrinseca in maniera indipendente dalle caspasi. Oltre a questa funzione pro-apoptotica, studi recenti hanno dimostrato che AIF è anche in grado di regolare l’omeostasi energetica cellulare promuovendo la biogenesi e la funzione dei complessi respiratori multi-subunità. Sebbene i meccanismi molecolari alla base non siano stati ad oggi chiariti, è noto che questo ruolo è svolto grazie all’interazione di AIF con CHCHD4, una proteina solubile dello spazio inter-membrana dei mitocondri (IMS), che promuove l’ingresso nell’IMS e il folding ossidativo dei substrati appartenenti alle subunità dei complessi respiratori. Dato l'interesse nel chiarire il ruolo vitale di AIF nei mitocondri, abbiamo deciso di indagare l'interazione AIF-CHCHD4 sia dal punto di vista funzionale che strutturale. Ci siamo concentrati sullo studio del possibile impatto della porzione N-terminale di CHCHD4 (27 residui), sufficiente per legare AIF, sull'attività catalitica di AIF e sulla sua capacità di legare il NAD+. Si è scoperto che il peptide stimola l'attività DCIP-NADH reduttasica di AIF ed è stata stimata una Kd apparente del complesso AIF-peptide nel basso micromolare. Un’altra interessante scoperta è stata la capacità di AIF di legare NAD+ solo in presenza del peptide. Gli esperimenti indicano che l’interazione con NAD+ è fortemente stimolata dall'abbassamento della temperatura e che tale effetto è secondario all'interazione AIF-peptide. Lo stesso effetto è stato ottenuto anche con la forma intera di CHCHD4. Inoltre, è stato osservato che il legame di CHCHD4 o del suo peptide modula anche la reattività di AIF verso composti contenenti gruppi tiolici, suggerendo un possibile ruolo di AIF nell'assistere il folding ossidativo dei polipeptidi contenenti disolfuri all’interno dei mitocondri. L'interazione tra AIF e CHCHD4 è stata poi ulteriormente studiata attraverso diverse tecniche biofisiche come la cromatografia analitica ad esclusione molecolare, ThermoFAD, termoforesi e calorimetria. In particolare, abbiamo scoperto che AIF e CHCHD4 formano un complesso eterodimerico, la cui stabilità dipende dalla temperatura, con un'affinità di legame nel basso micromolare per AIF ossidata e nel basso nanomolare per AIF ridotta. Per la determinazione delle caratteristiche strutturali del complesso, abbiamo utilizzato il software AlphaFold per costruire un modello, che è stato poi confermato sperimentalmente da analisi di spettrometria di massa sul complesso AIF-CHCHD4 covalentemente legato. Poiché il legame del peptide e di NAD+ mostrano una forte cooperatività positiva, abbiamo utilizzato queste informazioni per determinare le condizioni ottimali per gli studi di diffrazione a raggi X, attraverso i quali abbiamo determinato la struttura cristallografica del complesso. Il sito di legame di AIF per CHCHD4 è stato ulteriormente validato tramite esperimenti di mutagenesi su AIF.
Tipologia IRIS:
Tesi di dottorato
Elenco autori:
E. Fagnani
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