IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A NOVEL NFIX PHOSPHORYLATION IN SKELETAL MUSCLE
Tesi di Dottorato
Data di Pubblicazione:
2022
Citazione:
IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A NOVEL NFIX PHOSPHORYLATION IN SKELETAL MUSCLE / G. Mura ; thesis committee member: R. Mantovani ; thesis committee member: S. Molinari ; thesis committee member: M. Murgia ; thesis reviewer: A. Pisconti ; thesis reviewer: S. Tajbakhsh ; scientific supervisor: G. Messina. Dipartimento di Bioscienze, 2022 Jul 19. 34. ciclo, Anno Accademico 2021.
Abstract:
Nfix è un fattore di trascrizione coinvolto in diversi processi biologici che vanno dallo sviluppo di diversi tessuti (cervello, muscoli, sistema immunitario) ai tumori. Mutazioni del gene Nfix sono anche alla base di due malattie genetiche rare: la sindrome di Malan e la sindrome di Marshall-Smith. Nel muscolo scheletrico, Nfix guida la transizione dalla miogenesi embrionale a quella fetale durante lo sviluppo. Nell'adulto, Nfix regola la corretta tempistica di rigenerazione del muscolo scheletrico in seguito a una lesione, regolando l'espressione dei geni chiave nelle cellule staminali muscolari e la conversione dei macrofagi da fenotipo M1 a M2. Il silenziamento di Nfix nei topi distrofici porta a un miglioramento morfologico e funzionale del fenotipo distrofico rallentando i cicli di degenerazione-rigenerazione, indirizzando le fibre muscolari verso un fenotipo a contrazione lenta, e limitando la deposizione di tessuto fibrotico.
Nonostante il ruolo chiave di questo fattore di trascrizione, ad oggi manca una comprensione approfondita dei suoi meccanismi regolatori nel muscolo scheletrico e in condizioni patologiche. Studi incentrati sulle modifiche post-traduzionali di Nfix sono fortemente sottorappresentati in letteratura. Questo lavoro mira a colmare questa lacuna conoscitiva, attraverso la caratterizzazione delle modificazioni post-traduzionali di questa proteina e il loro ruolo biologico.
Con questo lavoro, dimostriamo che Nfix è fosforilato nei mioblasti del muscolo scheletrico, sia nei mioblasti fetali durante lo sviluppo che nelle cellule muscolari adulte, in vitro e in vivo. La presenza di almeno un sito di fosforilazione nel dominio C-terminale, trascrizionalmente attivo di Nfix, fosfo-serina 301 (pS301), è stata confermata sia in vitro che in vivo nelle cellule e nei tessuti muscolari scheletrici. I nostri dati sono supportati da numerosi dati di proteomica, inclusi dati provenienti da biopsie muscolari umane. La serina 301 di Nfix è molto ben conservata in diverse specie di vertebrati, suggerendo una importanza funzionale. La carica negativa portata dal gruppo fosfato sulla serina 301 causa una alterata corsa elettroforetica di Nfix e può pertanto essere riconosciuto tramite esperimenti di western blot. La fosforilazione della Ser 301 viene rilevata già durante la miogenesi fetale e i suoi livelli rimangono costanti durante il differenziamento dei mioblasti postnatali in coltura. Dati provenienti da linee cellulari ottenute da mioblasti murini Nfix-null trasdotti con mutanti fosfo-deficienti (S301A) e fosfo-mimetici (S301D) di Nfix non rivelano anomalie fenotipiche evidenti, sia in proliferazione che in differenziamento. Questa fosforilazione è invece indotta con l’attivazione delle cellule staminali muscolari (MuSC), poiché è assente nelle MuSC appena isolate dal tessuto (quiescenti) ma presente in quelle messe in coltura (attivate). Esperimenti di RNA-seq eseguiti su mioblasti che esprimono S301A-, S301D- ed Nfix2_WT hanno rivelato un ruolo di Nfix nella regolazione del ciclo cellulare, differenziamento, metabolismo cellulare e nei processi di adesione cellulare, tutti processi differenzialmente regolati tra MuSC quiescenti e attivate. Abbiamo inoltre dimostrato che questa fosforilazione è sensibile allo stress ossidativo e all'inibizione del proteasoma, poiché diminuisce significativamente in mioblasti trattati con perossido di idrogeno (H2O2) e inibitori del proteasoma.
Per concludere, evidenziamo un possibile ruolo per pS301-Nfix nella regolazione dell'attivazione delle cellule staminali del muscolo e nella progressione del ciclo cellulare. La scoperta di questi nuovi meccanismi regolatori di Nfix potrebbe essere impiegata in un contesto distrofico per manipolare l'attività trascrizionale di Nf
Tipologia IRIS:
Tesi di dottorato
Elenco autori:
G. Mura
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